液相色谱柱得应用ding教案.docx

液相色谱柱得应用ding教案液相色谱柱的应用ding目录一、液相色谱分离原理二、液相色谱柱的结构三、液相色谱柱的选择四、色谱柱的使用五、分析条件的影响六、色谱柱的维护一、HPLC分离原理样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分在流动相和固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离 (必要条件)分配过程分配系数-KK=K=常数（T恒定）Cm=组分在流动相中的浓度Cs=组分在固定相中的浓度CSCm容量因子k00tttkR是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比 在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数容量因子(capacityfactor)，也称分配比(partitionratio)，以k表示 k=Ms/MmMs为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质量由保留时间计算出容量因子，即可由实验测定容量因子k色谱理论：塔板理论-柱分离效能指标色谱理论：速率理论-影响柱效的因素速率理论是荷兰学者范弟姆特于1956年提出的,表述了影响柱效的因素及提高柱效的多种途径，其核心是速率方程（也称范弟姆特方程式）。

速率方程H=A+B/u+CuH：理论塔板高度；u：流动相的线速度色谱理论：速率理论-影响柱效的因素H=A+B/u+Cu色谱理论：分离度分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比 R=2（TR2-TR1）/（W2+W1）计算表明：1：R0.8时，两组分不能完全分离2：R=1时，两组分峰重叠约2%3：R=1.5时，两组分峰完全分离 R值越大分离越好，反之则峰重叠愈多 降低柱温、增加柱长可使R提高 样品组分的分离液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器泵输液分离检测记录AEGBCDF进样阀进样HPG-3x00RS泵在整个流速范围下保持800bar高压最高流速达到5ml/minWPS-3000RS自动进样器进样周期15秒进样阀耐压1000barTCC-3000RS柱温箱5-110C温度范围柱后冷却DAD-3000RS检测器全波长扫描范围数据采集速率100HzAcclaim2m色谱柱耐压800barChromeleonCMS软件及时获得结果UltiMate3000RSLC快速分离液相2022/2/2313高性能UltiMate3000x2三元梯度系统有六通道脱气机的溶剂架独特的双梯度泵：两个三元梯度泵封装在一个机箱内带温控选项的自动进样器独特的柱温箱可放置两个柱切换阀可变波长或二极管矩阵紫外可见光检测器与变色龙软件结合，这是一台真正独一无二的快速的双系统液相色谱液相色谱柱的应用二、色谱柱的结构和安装色谱柱的构造.色谱柱管常用内壁抛光的不锈钢管作色谱柱的柱管以获得高柱效。

使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3对柱内壁作钝化处理 钝化时使用HNO3在柱管内至少滞留10min，以在内壁形成钝化的氧化物涂层 色谱柱规格内径：常用4.6mm，3.9mm，2.1mm柱长：常用50，100，150，250cm色谱柱的构造色谱柱管由柱接头、柱管及滤片组装而成 柱接头采用低死体积结构，柱接头两端是螺纹组件连接，中间放置压环用于密封 为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉 压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸) 色谱柱子的构造不同厂家和型号的柱子会有一定的差别液相色谱柱的构造在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网)，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失 空柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用 但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀 色谱柱的构造柱填料：液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

常用颗粒粒径在310m的范围内 正相柱：多以硅胶为柱填料 另一类正相填料是硅胶表面键合CN，-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料 常用的其他的反相填料还有键合CCC-NH苯基等 液相色谱柱的安装色谱柱的安装：（1）拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂 （2）拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用 液相色谱柱的安装（3）按柱管上标示的流动相流向，将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许，建议在柱前使用保护柱)；柱的出口与检测器连接 连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管 连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环 在接管时一定要设法降低柱外死体积 连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧14-12圈，切记不要用力过大 如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧4圈，直至不漏液为止。

连接接管必须注意：如果伸出的管线长度过长，可能漏液螺母坡度不匹配，密封性差死体积区如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积色谱连接注意事项1.尽量减少死体积连接管线与接头0.12mm内径管线用于毛细管HPLC中2000分子量2000低分子凝胶渗透色用硅胶的正相模式用键合相的正相模式1.填料：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等（封端技术）2.键合相：CCC苯基、氨基等3.孔径：60-100A分子量20004.粒径：2um-10um5.内径：10mm以下（分析），10mm以上（制备）6.长度：130mm柱子的选择性能参数正相&反相色谱正相色谱极性:固定相流动相固定相-极性流动相(正己烷,异丙醇)-非极性极性物质后出峰反相色谱极性:固定相BC反向色谱法固定相（非极性）C18,C8,C4,苯基流动相(极性)Water,MeOH,MeCN,THFTypeofCompounds:中性，弱酸，弱碱溶剂极性各种反相填料的使用比例C18PhenylC4C8其他C18PhenylC4C8其他反向色谱法高极性流动相中极性流动相极性:ABCABCABC流动相1.反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O甲醇乙腈乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃最常用的流动相组成是：“甲醇H2O”和“乙腈H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑“甲醇H2O”流动相。

2.正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇最常用的是正已烷，不同混合溶剂的粘度比较柱填料基质硅胶基质-pH28Al2O3.nH2O-pH114聚合物基质-pH114高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀，导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损色谱柱的性能参数物理性质硅胶纯度色谱柱尺寸颗粒形状粒径表面积孔径键合类型碳覆盖率封端化学性质色谱柱的物理性质硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸色谱柱子的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径,通常3-10m表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300硅胶纯度A类硅胶由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不易发生拖尾？一般金属浓度2,000,选择300的孔径比表面积的比较比表面积与孔径的影响大孔径填料适用于大分子分析大孔径300全多孔色谱柱可用于分离蛋白质和多肽色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配300孔径可改善蛋白质和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300SB-C18(300)SB-C18(80)PW1/2孔径,分子量对峰宽的影响(梯度分离)选择合适的填料孔径分析大分子可获得最佳峰形300孔径可改善大分子的峰形色谱柱:4.6x150mm,5mm流动相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min温度:RT检测器:UV282nm溶液中的分子尺寸决定适宜的色谱柱孔径窄的峰宽表明待测分子进入填料孔没有受到阻碍SB-C3(80)300SB-C3(300)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰乐菌素)MW.926分子量虽小但体积较大的分子色谱柱化学性质键合类型单齿键合-键合相分子与基体单点相连双齿键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率与基体物质相连的键合相的量封端键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来键合类型键合类型对色谱分离的影响：单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO碳载量碳载量是指固定相中碳的含量不同的键合相有不同的键合密度，并决定固定相的本质。

一般CC18的碳载量为10%14%，高的可达18%20%碳载量碳载量-对色谱分离的影响高碳载量：保留强，提高分辨率,分析时间长低碳载量：保留弱，缩短运行时间碳载量封端技术封端-对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品和碱性样品，未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异固定相键合二甲基硅烷封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)传统键合及封端技术三基封端技术（酰胺基）PG=极性酰胺基，R1=空间保护的异丙基，R=烷基链柱子稳定性更好，寿命更长超临界封端技术传统封端：固-液回流封端，封端试剂和催化剂溶于有机溶剂中（甲苯），与键合相在有机溶剂沸腾温度回流数小时至数天不等 硅胶小孔难到达 超临界封端：封端试剂和催化剂由CO2超或亚临界流体传递，封端试剂在超或亚临界流体状态下扩散系数是固-液回流状态的1000倍，能充分扩散到硅胶表面和小孔内部，只需要数小时就可以最大限度封闭活性硅羟基。

碱灭活测试色谱柱Diamonsil（钻石）C185um，250x4.6mm流动相CH3OH/H2O(49:51)流速1.0mL/min检测UV254nm如果硅胶表面已经被完全化学改性，乙基苯胺的三个异构体将不会与硅胶发生非极性作用力，所以不会分离并共同洗脱出来 封端技术比较保留值与pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um部件号：880975-906流动相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.保留值与pH的关系12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75m。