绿色荧光蛋白GFP基因地克隆和表达.doc

word绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白〔green fluorescent protein，GFP〕是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团如此位于大空腔内发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团如此位于大空腔内。

实验一 质粒DNA的别离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA提取方法：碱裂解法该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA，比拟方便、省时，提取的质粒DNA质量较高，可用于DNA的酶切、PCR甚至测序二、根本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位迄今为止，从细菌中别离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量X围从1kb到200kb质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是一样的有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时〔例如经氯霉素处理〕，细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌如此表现出抗药的新表型。

借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个根本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒DNA的别离；质粒DNA的纯化1、 细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养对于松弛型质粒〔如pUC系列〕来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA但对于严谨型质粒〔如pBR322〕来说，如此需在得到局部生长的细菌培养物中参加氯霉素继续培养假如干小时，以便对质粒进展选择性扩增2、菌体的收集、裂解和质粒DNA的别离质粒别离的根本原理是利用宿主菌〔一般是大肠杆菌菌株〕DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：〔1〕大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多〔2〕从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子这里主要介绍碱裂解法的根本原理：在细菌悬浮液中参加SDS〔十二烷基硫酸钠〕和NaOH使菌体裂解〔有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁〕。

此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开当条件恢复正常时〔如参加酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH〕，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中3、质粒DNA的提纯对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去剩余蛋白质与RNA，达到纯化的目的质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA〔cccDNA，SC构型〕、开环DNA〔OC构型〕和线性分子〔L构型〕在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量一样，但具有不同的电泳迁移率其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA三、实验材料、仪器与试剂1. 在含有pEGFP－N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种，置于含有5mL LB培养基的试管中摇晃过夜 在含有pET-28a质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱四、实验步骤1. 取1.5ml DH5α培养液倒入1.5mL eppendorf 管中, 13000rpm离心1min。

2. 重复13. 弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽 4. 菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置10min 5. 参加新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管5次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5min 6. 参加150μL预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次,使沉淀混匀,冰浴中15分钟,13000rpm离心5min 7. 上清液移入干净eppendorf 管中,参加等体积的氯仿/异戊醇(24：1),振荡混匀, 13000rpm离心2min 8. 将水相移入干净eppendorf 管中,参加等体积的氯仿/异戊醇(24：1)振荡混匀, 13000rpm离心2min 9. 将水相移入干净eppendorf 管中,参加2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后，置于室温下2min，然后13000rpm离心5min 10. 弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,参加1mL 70％乙醇洗沉淀一次, 振荡混匀后，13000rpm离心5min 11. 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,室温枯燥 12. 将沉淀溶于30μL TE缓冲液(pH8.0，含20μg/mL RNaseA)中，保存在-20℃冰箱中。

13. 按照同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20℃冰箱中五、实验结果实验二 质粒DNA浓度的测定一、实验目的学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度二、根本原理核酸分子在260nm下有最大吸光值，因此可以通过260nm下核酸的吸光值计算核酸浓度〔mg/ml〕，并通过测定与280nm和230nm的比值，估算DNA的纯度三、实验材料与仪器1、实验材料pEGFP－N3和pET-28a DNAEppendorf核酸蛋白测定仪，移液枪四、实验步骤1. 按下Eppendorf核酸蛋白测定仪dsDNA，比色皿中参加100μl ddH2O，blank空白对照2. 取一0.5ml离心管，吸取质粒DNA 5μl，然后再参加95μl ddH2O，混匀3. 将100μl的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡4. 按下sample，记录260nm下DNA的浓度〔mg/ml〕并同时记录OD260nm/280nm，OD260nm/230nm的比值，估测DNA的纯度5. 计算质粒DNA母液的浓度=OD260nm下的浓度×20〔mg/ml〕，DNA的纯度：OD±0.1(如果低于1.7，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于1.9，说明样品中RNA去除的不完全。

) OD实验三 琼脂糖凝胶电泳一、实验目的学习掌握一种最常用的别离、鉴定、纯化DNA片段的比拟方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的根本原理和操作方法二、根本原理影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：〔1〕DNA分子的大小 双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子〔2〕琼脂糖浓度 给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存性相关〔3〕DNA的构象 超螺旋环状〔Ⅰ型〕、切口环状〔Ⅱ型〕和线状〔Ⅲ型〕DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反〔4〕所用的电压 低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加所以，当电压增大时琼脂糖凝胶别离的有效X围反而减小要获得大于2kb DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。

〔5〕电泳缓冲液 DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响缺乏离子如此电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢高离子强度时〔如10×buffer〕，电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性三、实验材料、仪器与试剂1、实验材料质粒DNA2、使用仪器核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪四、实验步骤1、 1%琼脂糖凝胶的配制〔1〕加20ml 1×TBE缓冲液于三角瓶中，〔2〕准确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，〔3〕冷却至60℃左右，〔4〕轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上，〔5〕将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液〔TBE〕中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，〔6〕取5μl质粒DNA与2μl GeneFinder混匀上样〔8〕蓝盾可见光透射仪观察结果五、实验结果实验四 酶切与连接1. 实验目的学习使用限制型内切酶进展DNA酶切的原理和方法2. 实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类II型酶在其识别位点之中或临近确实定位点特异地切开DNA链。

它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↓G-5’II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR I、Hind III、BamHI和Not I这样在识别序列中进展切割的酶这一类酶是构成商业化酶的主要局部大局部这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列一些酶识别连续的序列〔如EcoR I识别GAATTC；Hind III识别AAGCTT;BamHI识别G↓GATCC; Not I。