分析测量图象软件Imagepro(DOC).doc

分析测量图象软件Imagepro-Plus教程一、入门Imageproplus（IPP）的主要用途是分析测量图象本人使用该程序进行生物图象分析有一段时间，写此帖的主要目的还是与大家交流使用心得，并总结一下使用方法 如果你是刚接触IPP，最好先从本帖看起，并同时打开你电脑上的IPP程序照着操作学会一个软件需要花一段时间的，两分钟不可能学会两小时也太短但我相信，照着我这几个帖子作下来，至少是可以用IPP干一点事情了打开IPP后的界面是这样的，该从何处下手呢？  既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛  这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分处理目标是通过测量图片中黄色部分的"黄"度来反映相应蛋白表达的的“量”对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，这部分区域是我们最感兴趣的地方，叫作AOI（area of interest）AOI是IPP中最有用最重要的概念如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。

对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，就这张图片来说，AOI是黄色区域，因此用颜色分类的AOI工具是最有效的点击measure---count/size,弹出分类测量窗口 在窗口中选中manual，再点击select color，弹出颜色选择窗口segmentation，这个工具是IPP最有特色的颜色选取工具之一用好这个工具是使用IPP的要点  对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是最简单的点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色用红框圈起来的四个工具按纽分别是：吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色图片中被标上红色的区域被定义为一个class，其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个class，其中每一个细胞核就是一个object  选取完AOI后，点击close回到count/size窗口，下一步就可以对选中的object进行测量操作了。

点击count/size窗口中的measure菜单，点select measure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有：area面积density（mean）平均光密度diameter直径IOD（integrated optical density）累积光密度在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了 选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的OK纽，关闭这个窗口，就回到了count/size窗口，再点击一下count按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据分别点击count/size窗口中view菜单中的measurement data和statistics，就分别弹出这两个数据窗口前者是这个calss中每一个object的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。

统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有object的数目  测量数据转入EXCEL处理起来最方便只要在数据菜单中点file - DDE to EXCEL数据就传到EXCEL的sheet1里去了在这个示例图片的统计数据中，samples为图中所有细胞核的个数，第一列为area，其中的Mean值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值但IOD却是SUM值更有意义 订正：在上述操作中漏掉了一个重要步骤，就是要转换图象intensity格式在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的转换光密度单位的方法如下：点击：measure--carliberation--intensity，调出intensity校正窗口然后在窗口中点new按纽，再点一下下面的std optical density选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线然后还要点一下最上面的system按纽。

最后点close关闭窗口这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位关于光密度较正的详细内容请参见第十帖校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了整个分析测量过程就是这样当然，光知道这一点是远远不够的在以上所述各个步骤中有许多技巧和方法能使测量数据更加准确合理本人将另发帖子分别详细叙述此主题到此结束  二、AOI技巧在阅读这篇帖子之前，希望你看一下(1.入门 这个工具的标题叫Magic wand，就是photoshop中的魔棒呀将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域这里"相似"的定量范围由Range的值来决定较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域较小的range值则为较小的灰度范围在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明smooth值是用来平滑区域边界的一般不需要平滑，因此默认值为零  选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域，不能直接点选，要先点击一下工具栏上的Multiple AOI按纽，再点击add，接下去就可以到另一个选择区域点选。

选好一个新的区域后再回去点Multiple AOI--add确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下newAOI按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域  这个irregular工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个trace按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个AOI第一种是手画法确认工具条右边的Auto选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形，点右键结束用鼠标画当然是不会准确的实在没别的招了才会出此下策第二种方法是自动寻迹把那个Auto给选上，speed值给减到1(慢速看得清楚)，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个AOI重复选取多个AOI的方法与楼上一样如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此处时会乱走一气。

这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止最后点一下右键围成一个闭合的AOI围好的AOI边界是绿色框   自动寻迹挺好玩吧?不过别忘了我们的目的选好了一个个的AOI后当然是要测量每个区域的几何尺寸及光密度啦下面该怎么作呢?点开count/size窗口，点菜单EDIT---convert AOI to Objects.这样就把刚才选中的一个个AOI变成了要测量的object了，那些小区域的颜色也由AOI绿色外框线变成了object的标记了object的标记类型是可以自己设定的在count/size窗口右边有一个option按纽，点开它就能设定object标记的外观了在option窗口中，outline style可以选outline(轮廓线)或filled(填充class颜色)label style 可以选择为object序号或测量值再下面是label的文字颜色右上角还有一个class的颜色选择按纽估计大家自己试一下都会用的  下一步是点measure菜单下的select measurements选上要测量的项目。

注意，选完后要点击这个菜单中的measure按纽(而不是count/size窗口中的count按纽)然后是OK按纽关闭measure窗口，点开view菜单下的measurement date和statistics数据窗口几个object的测量数据就已经在里面了如果你还想继续增加objcet，可以直接用irregular工具画AOI，然后点convert AOI to object这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的object测量数据会立即被更新   在上面讨论的主要是irregular工具，它对于大个的孤立图形对象的选取是有用的而面对组织切片中密密麻麻的细胞，就得用本主题讨论的segmentation工具了实际上，在第一部分入门中所用的就是segmentation工具，在那里我用颜色吸管选取了图片中蓝色的细胞核，但是如果仔细观察一下选取的效果就会发现，有一些挨在一起的两个以上的细胞核被识别成了一个，另有一些蓝色的杂质颗粒被错误地识别成了细胞核如果你试着用吸管工具选取一下图中黄色的免疫反应表达区域，就会发现因为黄色很浅，很不容易准确地选取所以对于segmentation工具还需要有更多的应用技巧。

火锅在我之前已经介绍了不少，我在这里班门弄斧是为了保持我这个系列主题的内容完整同时也是系统地整理一下这个工具的使用方法让我们还是从打开图片并调出count/size窗口开始吧  对这种色彩饱和度低，各种成分颜色区别很小的图片来说，用吸管是很难准确选择到正确的颜色区域的在count/size窗口里选中manual，并点select color调出segmentation窗口窗口里有两个。