ⅠFGF信号通路与P19细胞神经命运决定Ⅱ荧光共振能量转移研究bHLH蛋白的相互作用.pdf

摘要摘要第f 部分：F G F 信号通路与P 1 9 细胞神经命运决定多潜能的小鼠P 1 9 胚胎性癌细胞经视磺酸( r e t i n o i ca c i d ，R A ) 诱导，同时形成细胞团，可以分化为神经元和神经胶质细胞免疫染色显示在R A 诱导4 天后形成的细胞团r } J ，P 1 9 细胞表达神经干细胞特异的标记分子n e s t i n 和S o x 这监P 1 9 神经T 细胞在细胞团内排列成类似神经管的r o s e t t e 结构，提示R A 诱导的P 1 9 细胞神经分化过程经过神经干细胞阶段，是个研究神经细胞命运决定的细胞模型已有的研究表明，R A 诱导和在体外形成具有紧密结构的细胞叫是P 1 9 细胞神经分化的两个必要条件为探讨细胞团的形成如何参与决定P 1 9 细胞的神经分化命运，我们观察并发现成纤维细胞生长因了8 ( F i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r8 ，F G F 8 ) m R N A 和蛋白质的表达水平在P 1 9 细胞形成细胞团的2 4 小时内有一过性的上调，提示F G F 8 是一个P 1 9 细胞成团响应分子。

在单层培养的P 1 9 细胞中过量表达F G F 8 可以促进R A 诱导的P 1 9细胞神经分化，分化后的神经细胞不仅表达神经元的标记性分子T u J l 、M A P 2N F l 6 0 和G A P 4 3 ，还表达神经胶质细胞的标记性分子G F A P , 提示F G F 8 的过量表达可以替代P 1 9 细胞神经分化必需的成团过程我们利用R N A 十扰，可溶性F G F 8 受体F G F R 3 ．F c 融合蛋白和F G F 受体抑制剂S U 5 4 0 2 等方法干扰F G F 8 信号的传递，均可以抑制R A 诱导的P 1 9 细胞神经分化，提示成倒过程引起的F G F 8 表达上调对于P 1 9 细胞的神经分化是必需的对F G F 8 促进P 1 9 细胞神经分化分_ 了机制的研究显示，F G F 8 ¨J 以激活其F 游信号分- 了E r k l ／2 的磷酸化，并r 扰了B M P 下游转录因子S m a d l 存细胞核内的定位，以干扰B M P 信号通路利促进神经分化为检验F G F 信号通路存P 1 9 细胞神经分化过程中是否具有直接的神经诱导功能，我们建立了稳定表达S m a d 6 的P 1 9 细胞株，以抑制细胞内的B M P 信号通路。

该细胞株在无血清条件下可自发分化为神经细胞，而F G F R 的抑制剂S U 5 4 0 2 和E r k l ／2 磷酸化的抑制剂麓要U 0 1 2 6n J _ 抑制S m a d 6 ／P 1 9 细胞的神经分化，提不P 1 9 细胞成团过程引起的F G F 8 上调，一方向通过E r k l ／2 的磷酸化抑制S m a d l 的入核，另一方面则4 i依赖B M P 抑制，直接促进P 1 9 细胞的神经命运决定j 葶缮i 孔F G F 8 ，R A ，P 1 9 胚胎性痛细胞，细胞成团，神经诱导，神经命运决定，B M P - S m a d l第| | 部分：荧光共振能量转移研究b H L H 蛋白的相互作用b H L Hf b a s i ch e l i x —l o o p —h e l i x ) 家族成员是脊椎动物神经系统发育中的重要转录调控分子它们发挥功能的方式是：形成同源／异源二聚体后结合到E —b o x 上启动下游基因的转录b H L H 蛋白同源／异源二聚体在不同绌胞中结合的活性强度决定了它们发挥功能的组织特异性和时间特异性因此，建立在体内条件下观察和研究b H L H 蛋白一崔向相h ：作用的方法非常有意义。

我们构建了一系列b H L H 融合蛋白，以荧光共振能量转移( F l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r , F R E T ) 的方法分析b H L H 蛋白间的相互作用我们选择将广泛表达的E 4 7 蛋白与E Y F P 的融合蛋白作为F R E T 的受体，而将组织特异性表达的N e u r o D l ，M a s h l ，N g n l ，N g n 2 与E C F P 的融合蛋白作为F R E T 的供体通过钙转和鸡胚卵内电转的方法，将上述融合蛋白在H E K 2 9 3 T 细胞和鸡胚神绎管中瞬时表达与它们的转录冈子功能一致，瞬时表达的b H L H 融合蛋白定位在绌胞核中而在鸡胚神经管中，8 0 ％表达b H L H 融合蛋闩的细胞定位在神经管m a n t l ez o n e ( 山有丝分裂后的新’E 神经／i 构成) ，2 0 ％定位在v e n t r i c u l a rz o n e ( 由神经前体细胞构成) 利用受体光漂白的方法计算F R E T 效率，分析和比较了b H L H 蛋白一蛋白在H E K 2 9 3 T 细胞和鸡胚神经管m a n t l ez o n e及v e n t r i c u l a rz o n e 内相瓦作用的强弱。

结果提示M a s h l 和N g n 2 可能分别在v e n t r i c u l a rz o n e 和m a n t l ez o n e 与其下游基因调控区域的D N A 序列形成紧密I l擅要的D N A 一蛋白质转录复合物j 芒缮女孔荧光共振能量转移，蛋白相2 i 作用，共聚焦显微镜，鸡胚卵内电转b H L HI I I摘要A b s t r a c tC h e nW a n g ( B i o c h e m i s t r ya n dM o l e c u l a rB i o l o g y )D i r e c t e db yD r ．N a i - h eJ i n gP a r tI ：C e l la g g r e g a t i o ni n d u c e dF G F 8e l e v a t i o ni se s s e n t i a lf o rP 19c e l ln e u r f ld i f f e r e n t i a t i o nF G F 8 ，am e m b e ro ft h ef i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( F G F ) f a n l i l y , h a sb e e ns h o w nt op l a yi m p o r t a n tr o l e si nd i f f e r e n td e v e l o p i n gs y s t e m s ．M o u s ee m b r y o n i cc a r c i n o m aP 1 9c e l l sc o u l db ei n d u c e db yr e t i n o i ca c i d ( R A ) t od i f f e r e n t i a t ei n t on e u r o e c t o d e r m a lc e l ll i n e a g e s ，a n dt h i sp r o c e s si sc e l la g g r e g a t i o nd e p e n d e n t ．I nt h i sr e p o r t ，w es h o wt h a tF G F 8e x p r e s s i o ni st r a n s i e n t l yu p —r e g u l a t e du p o nP 1 9c e l la g g r e g a t i o n ，a n dt h ea g g r e g a t i o n —d e p e n d e n tF G F 8e l e v a t i o ni sp i u r i p o t e n ts t e mc e l lr e l a t e d ．O v e r - e x p r e s s i n gF G F 8p r o m o t e sR A —i n d u c e dm o n o l a y e rP1 9c e l ln e u r a ld i f f e r e n t i a t i o n ．I n h i b i t i o no fF G F 8e x p r e s s i o nb yR N Ai n t e r f e r e n c eo rb l o c k i n gF G Fs i g n a l i n gb yF G Fr e c e p t o ri n h i b i t o r , S U 5 4 0 2 ．a n e n u a t e sn e u r a ld i f f e r e n t i a t i o no fP 1 9c e l l ．B l o c k i n gt h eb o n em o r p h o g e n e t i cp r o t e i n ( B M P )p a t h w a yb yo v e r - e x p r e s s i n gS m a d 6i nP 1 9c e l l ，w ea l s os h o wt h a tF G Fs i g n a l i n gp l a y saB M Pi n h i b i t i o n —i n d e p e n d e n tr o l ei nP 1 9c e l ln e u r a ld i f f e r e n t i a t i o n ．K e y w o r d s ：F G F 8 ，R A ，P 1 9e m b r y o n i cc a r c i n o m ac e l l ，a g g r e g a t i o n ，n e u r a lf a t ed e t e r m i n a t i o n ，n e u r a li n d u c t i o n ，B M P , S m a d lI V■要P a r tI I ：V i s u a l i z a t i o no fb H L Ht r a n s c r i p t i o nf a c t o ri n t e r a c t i o n si nl i v i n gm a m m a l i a nc e l ln u c l e ia n dd e v e l o p i n gc h i c k e nn e u r a lt u b eb yF R E TM e m b e r so ft h eb a s i ch e l i x ——l o o p ，- h e l i x ( b H L H ) g e n ef a m i l yp l a yi m p o r t a n tr o l e sd u r i n gv e r t e b r a t en e u r o g e n e s i s ．I nt h i ss t u d y , c o n f o c a lm i c r o s c o p yb a s e df l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( F R E T ) i su s e dt om o n i t o rb H L Hp r o t e i n —p r o t e i ni n t e r a c t i o n su n d e rv a r i o u sp h y s i o l o g i c a。