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自然界中存在的核苷酸共有 11 种 ，其中 4 种比较常见 ，7 种较稀有 核苷酸是一类在代谢极为重要的生化物质除作为 DNA、RNA 的前体外 ，在细胞的生长代谢 、能量的储存和转化、免疫反应及信号传导中，都有核苷酸的参与核苷酸在食品行业中，已经由最初的食品助鲜剂 ，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂 ，特别是在婴幼儿食品中，核苷酸能有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生同时，核苷酸在抗癌，抗病毒 ，治疗心血管疾病、糖尿病及干扰诱导等方面具有独特的疗效 ，被用于多种药物的合成作为医药中间体，核苷酸主要用来制造腺苷三磷酸(ATP)、环腺苷酸、胞二磷胆碱聚肌胞、氟铁龙等抗病毒、抗肿瘤 、治疗心血管疾病药物据统计 ，目前核苷酸类物质可以合成 52 种抗病毒、抗肿瘤药物而这些药物有望成为继磺胺类药物抗生素之后的又一类新型的抗病毒、抗肿瘤药物此外 ，核苷酸还可作为农用激素调节植物生长 ，用于农作物的生产 ，有明显的增产、增重功效 20 世纪 60 年代 ，日本的国中明率先发现了利用橘青霉(Penicillium citrinum)提取 的 5’_磷酸二酯酶可以降解 RNA 生成 5’_核苷酸 ，随后，日本利用该方法首先开始了核苷酸的工业化生产。

在几十年的研究中，已形成生产核苷酸及其衍生物的多种方法，归纳起来主要有 4 种 ：化学合成法、RNA 酶解法 、微生物发酵法以及生物催化法 1 生产工艺 1．1 化学法 化学法生产核苷酸，通常是磷酸或者焦磷酸的活性衍生物对核苷酸进行磷酸酯化反应 一般常用的焦磷酸的活性衍生物有三卤氧化磷 、焦磷酰氯、双一对硝基苯焦磷酸等另外，要得到 5’一核苷酸，必须在磷酸化反应前以适当的保护基保护核苷上核糖的 2’，3’羟基一般采用乙酰基 、苄基 、 ‘I)一亚异丙基或苯亚基的功能化基团保护 目前已知的核苷酸化学合成方法主要有： (1)Ott 法 以 5’一核苷单磷酸三正丁胺盐与过量的 1，1’一碳二酰咪唑于室温下反应 1h，活化生成 5’一核苷单磷酰咪唑，将未反应 的 1，1’一碳二酰咪唑用甲醇除去 ；5核苷单磷酰咪唑与焦磷酸盐反应生成 5’一核苷三磷酸 反应产物用二乙胺基乙基 (DEAE)阴离子纤维树脂层析柱分离纯化采用 0～0．4mol 碳酸三乙铵进行梯度洗脱 ，所得的核苷酸三乙铵盐用 甲醇溶解 ，加入高氯酸钠转型成钠盐 (2)Ludwig 法 将 0．26mmol POCI3 加入到 0．5mL 磷酸三 甲酯和0．20 mmol 核苷悬浮液中，0℃搅拌 1．5h。

反应混合物中加入 2mL 浓度为 0．5mol ／L 的焦磷酸三正丁铵盐N，N 一二 甲基 甲酰胺(DMF)溶液和 0．2mL Bu3N ，迅速剧烈搅拌lmin 后加入 pH 值为 7．5 的碳酸三乙铵缓冲液水解反应产物用 DEAE 纤维树脂层析分离 ，洗脱剂为碳酸三乙铵盐 ，0～0．4mol 梯度洗脱，得到核苷酸三乙铵盐 化学法合成核苷酸经历 的步骤多、路线长 ，立体选择性差，所涉及的试剂昂贵，并有一定毒性 ，生产成本较高因此一般仅限于实验室规模生产一些有特殊用途的核苷酸的衍生物 ，难以达到工业规模 1．2 解法 20 世纪 60 年代 ，日本科学家发现 ，可以用从橘青霉 中提取的 5’一磷酸二酯酶降解 RNA 生成 5’一单核苷酸，从而生产具有呈味作用的 5’一鸟嘌呤核苷酸(GMP)从 1961 年起 ，以酵母 RNA 为原料，利用橘青霉和金色链霉菌生产 5’一磷酸二酯酶降解 RNA，开始了 5’_GMP 的工业化生产目前，在 日本有 40％的核苷酸是以 RNA 为底物酶解得到的酶解法生产 5’一核苷酸的工艺流程为 ：酵母经稀碱或浓盐抽提后 ，在 pH 值为 2．5 的条件下沉淀得到RNA。

再经 5’一磷酸二酯酶酶解 ，得 到 4 种核苷酸的混合液，将该混合物经离子交换树脂分离纯化可以得到 4 种核苷酸的纯品其中磷酸二酯酶主要是通过橘青霉固体发酵生产的核酸酶 PI它是一个胞外酶 ，提取后的粗酶液酶活一般在 0．0067-0．O12kat／L(即 400-700U／mL)，可以直接用于水解核酸 ，其水解率一般为70％～85％，由于酶解反应水解率不高 ，水解液中除了4 种核苷酸外 ，还存在大量的杂质一次性分离 4 种核苷酸本身难度就大 ，加上其他杂质 ，使得后续工艺对 4 种核苷酸的分离非常困难 徐焱通过对原始菌株的筛选 ，得到一个酶活可达0．017kat／L(即 1000U／mL)以上的橘青霉菌株，并改变了传统的固体发酵方式，用新型气升式反应器液体发酵生产核酸酶 PI，酶解率达到 90％，从而减轻 了分离工艺的压力 除了橘青霉的核酸酶 PI 外 ，还可从麦芽根中提取磷酸二酯酶进行酶解反应并通过将 5’一磷酸二酯酶和 5’一脱氨酶固定在树脂上实现了 RNA 的连续酶解反应 ，生产 5’_肌苷酸(5'_IMP)和 5’GMP其他的固定化技术研究还有用对氨基苯磺酰乙基纤维素或钛氯活化纤维素固定化 5’_磷酸二酯酶。

后者的活力 回收可达 70％，平均水解率为 74．6％，且载体成本低廉 ，固定化效果很好另外 ，中国科学院大连化学物理研究所用膜反应器实现了核糖核酸的连续水解生产核苷酸 ，核酸酶水解水平平均达到 80％，多个膜反应器串联使用 ，平均水解可达 90％但是水解一定时间后，聚砜超滤膜会出现部分堵塞的现象 ，需要处理且维护费用也较高 ，因此不适合大规模工业化生产 总的来说 ，酶解法生产核苷酸能一次得到 4 种核苷酸的混合物 ，且酶反应收率较高 ，但后提取过程中分离纯化得到 4 种高纯度产品的难度大 ，导致生产周期长，提取工艺烦琐，产品纯度不高但是由于该生产工艺简单 、原料来源丰富、成本低廉 ，所以长期以来我国都以此方法进行核苷酸的工业生产 l3 徽生物发酵法 微生物发酵法生产核苷酸，主要是利用微生物菌株的生物合成途径来生产核苷酸，所使用的菌种多为枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bac 埘 us subtilis)和 产 氨 棒 杆 菌(Corynebactedum ammoniagenes)前者主要用于生产核苷和嘌呤核苷酸，而后者是 目前利用微生物工业化合成核苷酸及其高级衍生物的主要菌种 1．3．1 嘌呤核苷酸的微生物合成 早在 1963 年，Momose 等就开始枯草杆菌的嘌核苷酸合成途径 的研究 ，发现枯草杆菌通过分解代谢利用碳源提供满足菌体生长和产物合成所需要 的量 ，同时也提供合成嘌呤、嘧啶和芳香族氨基酸的基本前体物一 5 一磷酸核糖。

后来 Nishikawa 等系统地对前体物 5 一磷酸核糖合成嘌呤核苷 、腺嘌呤系列物和鸟嘌呤系列物质的途径做了详细的研究 (见图 1)PRPP 转酰胺酶 、IMP 脱氢酶和 SAMP 合成酶是嘌呤核苷酸全合成途径的关键酶其中，PRPP 转酰胺酶受 GMP 和 AMP 的强烈抑制 ，GMP 与 AMP 能阻遏PRPP 转酰胺酶的形成 ，其抑制作用与 PRPP 是拮抗性的，同时添加 GMP 和 AMP 对该酶的抑制具有协同作用 ，是相乘性的结果，而且 ，如果腺嘌呤和鸟嘌呤都过量 ，该酶的合成就会被完全阻遏 ；若只限量鸟嘌呤就仅部分解除GTP、ADP 和 IMP 对该酶的抑制作用较差，三磷酸腺苷酸和腺嘌呤对该酶不产生抑制作用IMP 脱氢酶的合成不为腺嘌呤 、次黄嘌呤及黄嘌呤衍生物所阻遏，仅受 GMP 的阻遏SAMP 合成酶只专一性地受 AMP 的阻遏 枯草杆菌的嘌呤核苷酸合成途径是从 PRPP 经IMP 然后分为 2 条环形途径 ，加之此类菌 自身 5’_核苷酸酶活力强，因此常被用于嘌呤核苷的合成只要阻塞某一代谢途径(如选育遗传缺陷型菌株 、抗嘌呤核苷酸类似物 )解除反馈抑制 ，就能产生相应缺陷型的积累产物。

如 ，以肌苷产生菌为出发株 ，经多次诱变育种获得一株腺嘌呤回复、黄嘌呤缺陷型、GMP 还原酶缺失、抗 8 一杂氮黄嘌呤为主要遗传标记的变异株产生大量腺苷，可达 16g／L 产 氨棒杆菌 嘌呤核苷 酸 的生物合成途径 是从PfuPP 经 IMP 后分为 2 条直链途径 ，最终产生 AMP 和GMP，即没有图 1 中的反应(7)和(8) 使用产氨棒杆菌为出发株 ，经诱变育种后用发酵法直接产生 AMP 或 GMP 是十分困难的，因此常利用产氨棒杆菌的补救途径(见 图 2)进行 嘌呤核苷酸的合成培养基 中过量腺嘌呤和鸟嘌呤会抑制 PRPP 转酰胺酶，但会促使菌株通过补救途径(sal—vage pathway)合成嘌呤核苷酸补救途径 中的核苷酸磷酸化酶、核苷酸焦磷酸化酶和核苷酸磷酸激酶 ，都被多种嘌呤核苷酸所抑制 ，并且嘌呤碱基 、核苷 、核苷酸之间可能通过补救途径相互转化从 1964 年开始，日本科学家就开始了发酵合成核苷酸的研究T．Nara 等筛选多株具有核苷酸合成能力的菌种 ，并发现其中 Brevibacterium ammoni agenesATCC6872 能够在提供不同底物的情况下通过补救途径发酵合成不同核苷酸。

该课题组在 1964～1971 年间，先后用该菌成功地发酵生产了 IMP(>14g／L)、XMP(约 5g／L)、AMP(约 3．8 L)及 GMP(约 2g／L)在其工作 基础上 ，以 B．ammoni agenes ATCC6872 为出发株 ，筛 选各种突变体用于核苷酸生产的研究一直持续至今 1．3．2 嘧啶核苷酸的微生物合成 嘧啶核苷酸的合成的关键酶有：催化天冬氨酸和 氨甲酰磷酸生成氨甲酰天冬氨酸的天冬氨酸转氨 甲 酰酶(aspartate transcarbamoylase)、催化合成二氢乳清 酸的二氢乳清酸合成酶 (dihydroorotase)、催化二氢乳 清酸生成乳清酸 (ORA)的二氢乳清酸脱氢酶 (di—hydroorotate dehydrogenase)、将乳清酸焦磷酸化的乳 清酸焦磷酸化酶 (orotate phosphoribosyhransferase)， 以 及 乳 清 苷 酸 (OMP) 脱 羧 酶 (monophosphatedecarboxy lase)，它催化乳清 苷酸脱羧 生成尿苷酸 (UMP)UMP 被磷酸化为三磷酸尿苷酸(UTP)后 ，可 通过胞苷三磷 酸(CTP)合成酶(CTP synthetase)生成 CTP。

除了”从头”(di novo)合成途径外，嘧啶核苷酸同 样可以由嘧啶碱基通过补救途径合成 另外 ，与嘌呤核苷酸的合成途径不同 ，嘧啶核苷 酸的生物合成途径与某些氨基酸的代谢关系更为密 切 ，主要是作为前体的天冬氨酸盐能途经天冬氨酸 B 半醛生成高丝氨酸，进而被高丝氨酸脱氢酶催化生成甲硫氨酸及苏氨酸因此选育高丝氨酸脱氢酶缺失阻塞分支代谢途径 ，使不产生甲硫氨酸、苏氨酸副产物的菌株，是发酵产生嘧啶核苷和核苷酸的前提 由于尿苷酸对氨甲酰磷酸的合成有反馈抑制，同时，要解除合成尿苷酸之前 5 个 中间体必需酶的阻遏，可以通过选育尿苷酸的结构类似物一 2 一巯基尿嘧啶、6 一杂氮尿嘧啶的抗性菌株来解决乔宾福将一株野生型枯草芽孢杆菌通过诱变加上 2 一巯基尿嘧啶和6 一杂氮尿嘧啶的抗性标记 ，并使其嘧啶核苷磷酸化酶缺失 ，其尿苷产量达 65 L同一株出发菌再诱变获得胞苷脱氨酶缺失 、5 一氟胞苷抗性及高丝氨酸缺陷型的突变株，其胞苷产量达 30．2 g／L 枯草芽孢杆菌的 5’一核苷酸酶活性很高 ，一般用来合成核苷 ，而不能大量合成核苷酸 1971 年 ，KNakayama 等在嘌呤核苷酸发酵法合成 的研究基础上 ，利用 B．ammoniagenes ATCC6872 通过发酵法合成了 4．8g／L 的 UMP。

1．4 生物催化法 核苷酸是一种糖基磷酸酯，难以透过细胞膜在菌体发酵过程中除了要考虑解除反馈抑制外，还需考虑细胞渗透。