课件分子生物学基因工程和核酸杂交.ppt

1,4 基因工程,基因工程（DNA recombination）：又称DNA重组技术（gene engineering ），是指将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，并使其能在受体细胞内复制和表达的技术 分子克隆（molecular cloning ）：是指将目的DNA片段与载体重组，然后导入受体细胞，并在受体细胞中复制、扩增，以获得该DNA分子大量拷贝的技术2,4.1 工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 T4多核苷酸激酶 核酸酶S1,3,1、限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶4,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序Hin dⅢ,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,限制性核酸内切酶命名,5,,,,作用 Ⅰ Ⅱ Ⅲ,三种限制性核酸内切酶的作用,酶活性 核酸内切酶 核酸内切酶 核酸内切酶甲基化酶 甲基化酶ATP酶DNA解旋酶DNA链上的 无 有 有 特异识别位点DNA链上的 无 在识别序列内 在识别序列外 特异切割位点在分子克隆中 无 有 无 的重要意义,6,限制酶能识别双链DNA特异的48个碱基对，并在此序列内特异切割DNA。

限制酶功能：根据需要在特定的位点上精确切割双链DNA分子 回文结构（palindrome structure）：指双链DNA分子上按对称轴排列的反向互补序列（常为限制酶所识别）限制性核酸内切酶的作用,7,5——GAATTC——3,EcoRⅠ的识别序列：,,对称轴,3——CTTAAG——5 ,8,粘性末端（sticky end）：指限制酶错位切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端平末端（blunt end）：指限制酶平齐切开两条对称轴互补DNA双链所产生的末端—GAATTC— —CTTAAG—,EcoRⅠ,—CCC GGG— —GGG CCC—,,SmaⅠ,,,9,10,11,12,同工异源酶（isoschizomers）：指来源不同，但能识别和切割同一位点的酶同尾酶（isocaudarner）：指识别序列不同，但能产生相同粘性末端的酶如：BamH Ⅰ和Bst Ⅰ（G GATCC） Xho Ⅰ和 Pae R7（C TCGAG）,,,如： BamH Ⅰ（G GATC C）Sau 3A Ⅰ（N GATC N）由此产生的DNA片段可借粘性末端相互连接，在DNA重组时具有更大的灵活性。

13,1） DNA聚合酶Ⅰ和Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（ E . Coli DNA polymeraseⅠ ）是单一多肽链的多功能酶，分子量为103kD，它具有3种酶活性：① 5 →3 DNA聚合酶活性② 3 →5 核酸外切酶活性③ 5 →3 核酸外切酶活性,2、DNA聚合酶,14,,5→3外切酶 5→3聚合酶 3→5外切酶,,,,(103kD),35kD (小) 68kD(大),N,DNA 聚合酶Ⅰ,15,补齐双链DNA的3末端，同时可使3 末端DNA标记上同位素 cDNA克隆中，合成cDNA第二链 DNA序列分析Klenow片段的主要用途,16,Taq DNA聚合酶（简称Taq 酶）是一种耐热的DNA聚合酶，分子量为65Kd，最佳作用温度是70~80℃，Taq酶具有5→3 聚合酶活性和依赖于聚合作用的5→3外切酶活性 Taq DNA聚合酶可用于DNA测序及通过聚合酶链反应（PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增2） Taq DNA聚合酶,17,逆转录酶（reverse transcriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为逆转录过程。

逆转录酶是多功能酶 ① RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP） ② 核糖核酸酶H活性（RNaseH） ③ DNA聚合酶活性（DDDP）,3）逆转录酶,18,,,19,末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT，简称末端转移酶）：分子量为60Kd，在二价阳离子存在下，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3末端-OH上 末端转移酶的功能主要有： 在载体或目的基因 3末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接 用于DNA 3末端的同位素探针标记4）末端脱氧核苷酰转移酶,20,(A、G、C、T)n,(A、G、C、T)n,(A、G、C、T)n,（1）底物是单链DNA或有3突出末端的双链DNA，需要Mg2+2）底物是平端或3凹端的双链DNA，需要Co2+A、G、C、T)n,21,DNA连接酶（DNA ligase）：称为基因工程的缝纫针，它的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5磷酸基团与3羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的DNA连接起来 DNA连接酶包括大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶两种类型。

3、DNA连接酶,22,23,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的 5-磷酸基团主要用途有： 除去DNA片段上的5磷酸以防自身连接 在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素标记前，从RNA或DNA上除去5端的磷酸4、碱性磷酸酶,,5- pCpGpC ┅ ┅ -OH 3,碱性磷酸酶,5- CpGpC ┅ ┅ -OH 3,,24,5、T4多核苷酸激酶,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’,p,+ADP,+ATP,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’,5’- CpGpC ┅ ┅ -OH 3’ +ADP,p* +ATP,25,核酸酶S1可水解双链DNA、RNA或DNA-RNA杂交分子中的单链部分其主要作用有： 除去粘性末端以产生平末端 除去cDNA合成时形成的发夹结构 分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况6、核酸酶S1,+,26,4.2 载体,载体（vector）：指能携带外源DNA片段导入宿主细胞进行扩增或表达的工具。

载体的本质为DNA 制备的目的基因或DNA片段必须与合适的载体连接形成重组体，才能进入受体细胞并进行复制和表达 常用的载体有：质粒、噬菌体、粘粒、酵母质粒和病毒等27,1、克隆载体,克隆载体：能将载体外源DNA在受体细胞中复制、扩增并产生足够量目的DNA的载体28,能自我复制并具较高的拷贝数 分子量一般< 10Kb 带有遗传筛选标记 有适当的限制酶酶切位点，便于外源DNA的插入和筛选 多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）：载体上具有的多个限制酶的单一酶切位点克隆载体应具备的特征,29,1）质粒克隆载体,质粒克隆载体的主要用途： ① 用于保存和扩增< 2Kb目的DNA② 构建cDNA文库③ 目的DNA的测序④ 作为核酸杂交时的探针来源30,pBR322质粒克隆载体,pBR322质粒是由一系列大肠杆菌质粒DNA通过DNA重组技术构建而成的双链克隆载体，长为4.36Kb 它含有一个能保证高拷贝自我复制的复制起始点（Ori），并装有四环素抗性（Tetr）基因和氨苄青霉素抗性（Ampr）基因供菌落筛选 在这两个抗性基因中分别含有BamH I和Pst I等限制酶的单一酶切位点，用于插入外源DNA片段。

如有外源基因的插入，会导致这些标志性基因的失活31,pBR322载体,32,pUC系列载体,pUC系列载体是由pBR322质粒和M13噬菌体重组构建而成的双链DNA质粒载体 pUC18和pUC19质粒长约2.69Kb，除多克隆位点互为相反方向排列外，其它序列均相同 pUC质粒含Ampr，可供菌落筛选载体中装入一个来自大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因序列中含有多克隆位点33,pUC18载体,34,2）噬菌体克隆载体,噬菌体（bacteriophage，phage）：指感染细菌的病毒 按其生活周期分为两种类型： 溶菌性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，连续增殖，直到细菌裂解，释放的噬菌体又可感染其它细菌 溶原性噬菌体：指噬菌体感染细胞后，可将自身的DNA整合到细菌的染色体中，和细菌染色体一起复制35,野生型的噬菌体是线性双链DNA，全长约48.5Kb，其中60%（约30Kb）是溶菌生长所必需，中间40%的区域为非必需，可被外源DNA片段代替而不影响噬菌体的生存 噬菌体5末端含12核苷酸的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称为cos位点，噬菌体感染宿主菌后，其粘端通过碱基配对而结合，形成环状DNA分子。

噬菌体载体,36,噬菌体载体的结构,37,噬菌体载体的特点,重组噬菌体的分子量必须在野生型噬菌体的75% ~ 105%之间 筛选标记： 外源基因插入型：蓝白斑(LacZ)筛选 外源基因置换型：噬菌斑数目（转染率高100 ~1000倍）38,噬菌体载体的用途,① 用作一般的克隆载体 ② 用于构建基因组或cDNA文库（<22Kb） ③ 用于抗体库或随机肽库的构建 ④ 核酸的序列分析39,M13噬菌体,野生型M13噬菌体为6.4Kb左右的闭环正链DNA分子克隆的外源基因片段<1kb M13噬菌体能以单链和双链两种方式存在，可用于感染(经包装的单链DNA)和转化(双链DNA) M13中引入的多克隆位点，正好插入LacZ基因内，可利用蓝白色噬菌斑筛选重组体 M13噬菌体只降低宿主细胞的生长速度，而不溶解宿主细胞（呈溶源状态生长，故可从细菌培养液中获得噬菌体，制备单链DNA）40,M13噬菌体在细菌内的复制模式图,噬菌体 正链,复制型 DNA,,41,粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的cos位点构建而成 粘粒载体组成： 质粒复制的起始位点(Ori) 携带抗药基因 用于插入目的基因的单一酶切位点。

噬菌体的cos位点3）粘粒克隆载体,42,粘粒载体的特点,粘粒载体大小为4～6Kb，而插入外源基因长达40～50kb 加入噬菌体头部和尾部蛋白，可将粘粒包装成类似于噬菌体的具感染能力的颗粒，容易进入大肠杆菌 粘粒进入细菌后则完全失去噬菌体的功能，而表现质粒的特性43,粘粒载体的用途,① 克隆大片段DNA ② 构建基因组文库44,2、表达载体,表达载体是指能将外源基因在受体细胞中有效转录和正确翻译的载体 基因表达、合成有功能的蛋白质依赖于基因的有效转录、mRNA正确的翻译和翻译后加工45,报告基因（reporter gene）,为了判断某一待测DNA序列的生物活性，常采用报告基因方法 报告基因：是指处于待测基因下游并通过转录和表达水平来反映上游待测基因功能的基因，又称报道基因46,1）原核细胞表达载体,真核基因在原核细胞中表达需要保证外源基因： 插入方向的正确性； 受原核启动子的控制； 必须能在原核细胞中有效转录和有效翻译 外源基因在原核细胞中表达需要重要调控元件。