青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞负载树突状细胞后的免疫应答.doc

1青蒿琥酯诱导凋亡的 U937 细胞负载树突 状细胞后的免疫应答作者：郑智茵，王建峰，胡致平，沈建平，高瑞兰，叶宝东，林圣云，沈一平【摘要】 本研究探讨凋亡白血病细胞负载的树突状细胞（dendritic cells, DC）能否诱导特异性细胞毒 T 淋巴细胞反应 用青蒿琥酯诱导 U937 细胞凋亡, 从正常人外周血单个核细胞诱生 DC，将凋亡 U937 细胞负载 DC, 并添加 TNF α 诱导 DC成熟, 然后与自体 T 淋巴细胞共育,并联合 IL 2 以诱生细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）；应用流式细胞术分析 DC 和 T 细胞免疫表型, 采用 Dextran FITC 内吞试验检测 DC 的抗原摄取能力；用 ELISA 法检测 IL 12p70 的产生；采用 MTT 法检测凋亡 U937 细胞负载及未负载 DC 诱导的自体 T 淋巴细胞对不同的靶细胞（U937 细胞和 NB4 细胞）的杀伤效应结果表明：青蒿琥酯 1 μg/ml 作用于 U937细胞 48 小时后, U937 细胞的凋亡率达 51.52%, DC 在未成熟阶段时吞噬Dextran FITC 的能力最强，负载凋亡 U937 细胞之后并不能促使未成熟DC（iDC）分化为成熟 DC（mDC）。

凋亡 U937 细胞负载后的 iDC 在 TNF α 的作用下能够成为 mDC与未负载的 mDC 相比, 凋亡 U937 细胞负载后的mDC（mDC ApoU937）分泌 IL 12p70 水平明显增高, 而且由其所激发和扩增的T 细胞以 CD8+的 T 细胞为主细胞毒性实验显示: mDC ApoU937 诱导的 T 细胞的对 U937 细胞的杀伤显著超过对 NB4 细胞的杀伤结论： mDC ApoU937 能有效地诱导特异性抗白血病效应 【关键词】 白血病2Immune Response of Dendritic Cells Capturing Antigens from Apoptotic U937 Cells Induced by ArtesunateAbstract The objective of study was to investigate whether U937 cells loaded dendritic cells (DCs) could induce anti leukemic immune activity. The apoptosis of U937 cells was induced by artesunate(ART). DCs derived from peripheral blood mononuclear cells of health donors were loaded with apoptotic U937 cells, and induced to maturation in the presence of TNF α. Matured DCs were cocultured with autologous T lymphocytes, and combined with IL 2 in order to induce the leukemia specific CTL. The phenotypes of DCs and T lymphocytes were tested by flow cytometry. The ability of DC capturing antigens was measured by Dextran FITC endocytosis. The IL 12p70 level was assayed by ELISA kit. The proliferation of CTL and CTL activity were measured by MTT assay. The results showed that the apoptotic rate of the U937 cells was 51.2% when U937 cells were induced by 1 μg/ml ART for 48 hours in vitro. DCs had the most powerful ability of endocytosis in its immature phase. Apoptotic U937 cells could not induce the features of DC maturation, and apoptotic U937 cell pulsed immature DCs could be matured with TNF α. The IL 12p70 level secreded by apoptotic U937 cell loaded mature DCs（mDC ApoU937） was higher than that of non loaded mDC. The proliferation of autologous T lymphocytes co cultured with mDC ApoU937 was significantly remarkable and the content of CD8+ CTL was significantly higher in comparison with any other groups. CTL induced by mDC ApoU937 had stronger killing effect on U937 cells than NB4（p0.01）. It is concluded that the mDC ApoU937 can effectively generate T cell mediated青蒿琥酯诱导凋亡的 U937 细胞负载树突细胞后的免疫应答 目前, 以树突状细胞（DC）为基础的免疫瘤苗已在淋巴瘤、黑色素瘤、肾癌等恶性肿瘤的临床治疗中获得明显疗效, 但针对急性白血病的治疗尚处于探索阶段。

我们以健康正常人外周血单个核细胞来源的 DC 负载用中药青蒿琥酯诱导凋亡的 U937 细胞作为研究模型, 观察凋亡的 U937 细胞负载 DC 刺激自体 T 细胞转化为细胞毒 T 淋巴细胞（CTL）的能力, 探讨用凋亡的白血病细胞负载 DC 作为 DC 疫苗的可能性材料和方法主要试剂3正常人外周血白细胞层由浙江省中心血站提供；人单核细胞白血病细胞株 U937由本院血液病研究所提供；人急性早幼粒细胞白血病细胞株 NB4 由浙江大学肿瘤研究所提供；青蒿琥酯（artesunate, ART）为中国桂林第二制药厂产品；rhGM CSF购自厦门特宝生物股份有限公司；rhIL 4 和 rhTNF α 购自美国 Pepro Tech 公司；rhIL 2 购自沈阳三生制药股份有限公司；Dextran FITC（4 kD）购自美国 Sigma 公司；IL 12p70 ELISA Kit 购自法国 Diaclone 公司；PE/FITC 标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8 单克隆抗体购自美国 Becton Dickinson 公司； CD80、CD83、CD86、HLA DR 等购自美国 Pepro Tech 公司；RPMI 1640 培养液购自美国 Gibco 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；Genomic DNA Miniprep Kit V.2 购自上海申能博彩生物科技有限公司。

U937 细胞凋亡的诱导及检测按已报告的方法［1］, 取对数生长期的 U937 细胞, 调整浓度为 1×105 /ml，加入ART 的终浓度为 0.25 、0.5、1、2 μg/ml, 置 37℃、5% CO2 培养箱培养 48 小时, 离心收集细胞备用 取 1.5×106 U937 细胞，按 Genomic DNA Miniprep Kit V.2试剂盒说明书提取 DNA，2%琼脂糖凝胶电泳、紫外灯下摄片；同时，取 1.5×106 U937 细胞用 70%乙醇固定、加 RNase 及碘化丙锭（PI）固定后，进行FCM（FACScan 型,美国 Bacton Dickinson 公司产品）检测，用 Multicycle 2.50 DNA分析软件处理数据DC 的培养取 1 个单位的正常人外周血浓缩白细胞，经 0.9%生理盐水一倍稀释后，用 Ficoll密度梯度分离获得外周血单个核细胞（PBMNC），用完全培养液（CM）(RPMI 1640 4培养液中含 10 %的胎牛血请、100 U/ml 青霉素 G、100 μg/ml 链霉素)，调整细胞浓度为 3×106 /ml，置于 10ml 组织培养皿中，于 37℃、5 % CO2 条件下贴壁培养2 小时后，吸出非贴壁细胞（淋巴细胞）放-80℃冻存备用。

用 CM 轻洗培养皿 1 次后，加入含 rhGM CSF 100 ng/ml 和 rhIL 4 20 ng/ml 的 CM，于 37℃、5 % CO2条件下培养，第 3 天半量换液 1 次，培养 7 天，收集悬浮细胞，即为未成熟DC（iDC）；同样条件下，在培养的第 6 天添加 rhTNF α 50 ng/ml，继续培养 2 天，收集悬浮细胞，即为成熟 DC（mDC）DC 吞噬能力的测定分别提取 iDC、mDC 和非贴壁细胞（阴性对照），调整细胞浓度至 2×105/ml，3 种细胞各分为 2 组，即对照组和实验组, 2 组均加入 Dextran FITC 0.5 mg/ml，对照组置于 4℃，实验组置于 37℃，均孵育 30 分钟后，分别用 PBS 液洗涤 4 次，用FCM 分析结果凋亡的 U937 细胞负载 DCDC 培养的第 6 天，按凋亡的 U937 细胞:DC=1∶1 加入，共同培养 2 小时后，分为2 组: ①不加 rhTNF α 组; ②加入 rhTNF α50 ng/ml 组2 组分别继续培养 2 天后，①组 DC 称为 iDC ApoU937; 而②组 DC 称为 mDC ApoU937。

DC 分泌 IL 12p70 的检测分别收集 mDC 和 mDC ApoU937 的培养上清液，用 ELISA 法定量检测 IL 12p70 的含量，具体步骤根据试剂盒说明书进行5DC 表型的分析分别取 iDC、mDC、iDC ApoU937、mDC Apo 组 U937，用 FCM 检测各组 DC膜表面 CD80、CD83、CD86、HLA DR 分子的表达凋亡 U937 细胞负载的 DC 激发自体 T 细胞增殖能力的检测按上述方法获取的自体淋巴细胞作为反应的 T 细胞（1×105/well）, 分别以mDC ApoU937 和 mDC 作为刺激细胞, 按 T 细胞与 DC 比率为 10∶1 和 20∶1 接种于 96 孔板（每组 3 个复孔），每孔液体（含 IL 2 100 U/ml 的 CM）总量为 200 μl， 37℃、5% CO2 条件下培养 92 小时，加入 5 mmol/L MTT，20 μl/well，继续培养 4 小时；取出 96 孔板，水平离心 5 分钟，吸去上清液，加入 MTT 助溶剂 DMSO 200 μl/孔，充分溶解，用酶标仪于波长 570 nm 处读取 A 值。

对照为 IL 2 100 U/ml 培养的 T 细胞凋亡 U937 细胞负载的 DC 激活肿瘤抗原特异性 CTL 细胞毒作用的检测分别取 T 细胞与 DC 比率为 20∶1 共培养 4 天诱导的 T 细胞为效应细胞，分 3 组：mDC ApoU937 诱导的 T 细胞组；未负载的 mDC 诱导的 T 细胞组； 单纯 IL 2 100 U/ml 诱导的 T 细胞组各组 T 细胞在与靶细胞混合培养之前各取一部分用于 T 细胞表型检测，即细胞洗涤、离心后分别加入 CD。