土壤脲酶蔗糖酶磷酸酶活性的测定.doc

土壤酶活性的测定方法及部分样品配制详细请参考《土壤微生物分析方法手册》，《土壤酶及其研究法》土壤样品采集与制备土壤样品取样后混匀，用于土壤酶活性测定的土壤磨细过2nwi筛后，置于4 °C冰箱内保存备测1. 土壤酶活性的测定方法1.1. 腺酶采用靛酚蓝比色法方法原理：木法基于以尿素为基质，酶促水解牛成的氨与酚类化合物起反应 生成蓝色的靛酚，颜色深度与氨含量相关，用于尿酶活性的测定操作步骤：取10g风T•土，置于100ml三角瓶中，加2ml甲苯，15min后加 10ml 10%尿素液和20ml pH6.7柠檬酸盐缓冲液摇匀后在37°C恒温箱中培养3h 按此操作，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定，过滤后取0.5ml滤液 于50ml比色管中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定氮的标液：精确称取0.4717g硫酸按溶于水并稀释至1000ml,则得lml含 O.lmg氮的标准液绘制标准曲线时，可将此液稀释10倍供用PH6.7柠檬酸盐缓冲液：用368g柠檬酸溶于600ml水，另取295g氢氧化钾 溶于水，再将二种溶液混合，然后用1M的氢氧化钠调节pH到6.7,定容到2L苯酚溶液：称取苯酚（C6H5OH ） 10g和硝基铁鼠化钠[Na2Fe（CN）5NO2H2O] 100mg稀释至1L。

此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4°C 冰箱中保存次氯酸钠碱性溶液:称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠（Na2HPO4 • 7H2O,化学纯）7・06g、磷酸钠（Na3PO4 • 12H2O,化学纯）31.8g 和52.5g - L-1次氯酸钠（NaOCl,化学纯，即含5%有效氯的漂白粉溶液）10mL 溶于水中，稀释至1L,贮于棕色瓶中，在4°C冰箱中保存标线绘制：取稀释的标准液0、1、2、4、6、8、10ml,移于50ml容量瓶中,然后加入蒸憾水至20mL再加4mL苯酸钠溶液和4mL次氯酸钠溶液，随加随 摇匀30min后显色，定容在分光光度计上于578nm处比色根据光密度值与 溶液浓度绘制标线1.2. 蔗糖酶采用磷铝酸比色法方法原理：本法基于蔗糖酶酶解所得还原糖具有的还原性，能使磷钳酸络合物生成蓝色化合物，颜色强度与还原糖量相关，因而用比色测定还原糖量用于表示 酶的活性操作步骤：称5g 土，置于100ml三角瓶中，加入10ml水，1ml甲苯摇匀 使土壤均有分散后，放置15分钟，加入15毫升5%蔗糖■磷酸缓冲液，摇匀混合 物后，放入恒温箱，在37°C下培养24ho按此操作，用不加土壤的基质和150 摄氏度干热灭菌1小时的土壤进行对照试验，吸取0.5ml滤液于50ml比色管中， 按标准曲线步骤显色测定，pH5.5 磷缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.867gNa2PCU・2H2O溶于1L蒸憎水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078KH2PO4溶于1L蒸憾水中）9.5ml即成。

钳酸镀溶液：a） 5%钳酸鞍溶液；b） 200ml浓硫酸加入800ml水，使用前按 1:1将a与b混合5%蔗糖溶液（pH5.5磷酸缓冲液配制）铜试剂：a） 50gCuSO4 - 5H20 溶于 500ml 水;b） 25gNa2C03o 25g 酒石酸钾 钠，20g NaHCO3和200gNa2SCU溶于水并稀释到IL,加几滴甲苯防腐，使用前 按1:25将a与b混合标准糖溶液：将100毫克葡萄糖和100毫克果糖溶于水，稀释到200ml （I 毫克还原糖/I毫升）标准曲线的绘制：取不同体积，由0.5至50ml标准糖溶液于100ml容量瓶 中，加入10ml醋酸缓冲液，用水稀释到刻度，从每瓶中取2.5ml溶于50ml容量 瓶中，加入4ml铜试剂，摇匀，在烘箱内与105摄氏度左右放置25分钟，取出 冷却至室温，依次加入2ml 0.25M磷酸氢二钠和5ml钳酸鞍试剂，随加随摇匀， 待二氧化碳逸出后，放置1小时，摇匀，于578nm处比色测定1.3. 酸性磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法方法原理 本法基于以磷酸苯二钠为慕质，酶解释放出的酚，使其与氯代澳 苯醍亚胺试剂反应生色，用比色法测定出游离酚量，用其表示酶的活性操作步骤：称2.5g风干土置于I OOmL三角瓶中，加1.25mL甲苯，轻摇15min加入10mL0.5%磷酸苯二钠(酸性磷酸酶用醋酸盐缓冲液，中性磷酸酶用柠檬酸 盐缓冲液，碱性磷酸酶用硼酸盐缓冲液)，仔细摇匀后放入恒温箱，在37°C下培 养2h。

后于培养液中加50mL 0.3%硫酸铝溶液并过滤，按此操作，进行以水代替基质，及无土壤的基质对照测定，吸取0.5mL滤液于50mL容量瓶中，然后按 绘制标准曲线方法显色于660nm处比色.酚的标准溶液：(1) 酚原液：取lg重蒸酚溶于蒸憾水中，稀释至1L于棕色瓶中2) 酚工作液一取10ml酚原液稀释至1L,(每毫升含0.01 mg酚)标准曲线绘制：取0, 1, 2, 4, 6, 8, 10mL酚工作液，置于50mL容量瓶 中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二澳对苯醍亚胺试剂，显色后稀释至刻度, 30min后，在比色计上波长660nni处比色测定以光密度值为纵坐标，浓度为横 坐标绘成标准曲线.蔗糖酶所有的都要加基质，只是一份土是正常的，一份是在150摄氏度灭菌后的 土。