大肠杆菌感受态细胞的制备教学提纲.ppt

大肠杆菌感受态细胞的制备实验目的实验目的1. 熟悉感受态细胞制备原理2. 掌握大肠杆菌感受态细胞制备的方法制备感受态细胞可以使用电击法或化学法电击法是利用瞬时高压电流处理细胞悬浮液，使细胞膜发生去极化，产生微孔，悬液中的核酸就可通过微孔进入细胞电击转化需要仪器帮助化学法则更加简便，尤其适用于原核原核细胞胞感受态制备大肠杆菌感受态制备：RuCl法CaCl2法其原理是细胞在低温，低渗CaCl2（0.1M）作用下，会发生膨胀，Ca2+使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导细胞成为感受态细胞转化时混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，通过热刺激，液晶态细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入细胞操作步骤操作步骤细菌接种与培养菌接种与培养取-70℃冰冻大肠杆菌DH5α菌种，用划线法接种细菌于培养皿，做好标记，于37℃培养过夜第二天，从平板上挑取单个菌落，接种至含有3ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜次日取菌液30 μL接种至含有3 ml LB培养基的试管中，37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min）。

菌体收集菌体收集当菌落600nm OD值达到0.3~0.4时，将试管取出放置冰上10~15分钟在无菌条件下，取1ml菌液装入1.5ml离心管中4℃,5000rpm离心5min弃上清，将管倒置于干滤纸上1min，吸干残留的培养液制备感受态制备感受态(1)加200 μL 冰预冷的0.1M CaCl2到离心管中，振荡混匀，使菌体悬浮，冰浴30min2) 4℃,5000rpm离心5分钟，弃上清，将管倒置于干滤纸上，吸干残留液体3) 加50 μL冰预冷的0.1M的CaCl2，重悬浮菌体，放至4℃保存备用，24~48小时内使用效果较好如果暂时不用，可加入等体积的 30%的甘油（甘油终浓度为15%），混匀液氮速冻后保存于-80℃低温冰箱中待用，可保存半年以上注意事项注意事项细胞的生胞的生长状状态和密度和密度 最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液不要用已多次转接，或贮存在4℃的培养菌液应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液OD600控制DH5α菌株的OD600 为0.5时，细胞密度在5×107 个/ml左右，过高或不足均会使转化率下降注意事项注意事项防止防止污染染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等需要经高压灭菌处理。

所有的试剂都要灭菌，并注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则会影响转化的效率或是转入杂DNA 。