微生物限度检验标准操作规程.docx

微生物限度检验标准操作规程1 目的规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠2 依据《中国药典》 20XX 年版3 范围本标准适用于微生物限度检验4 责任中心化验室负责人：对本规程的实施负责中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作5 程序5.1 执行标准： 《中国药典》 20XX 年版5.2 抽样：照《取样标准操作规程》进行6 细菌、霉菌及酵母菌计数计数方法包括平皿法和薄膜过滤法 检查时， 按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定6.1 设备、仪器及用具6.1.1 设备微生物限度检测室室、 净化工作台、 生化培养箱 ( 30-350C ) 、生化培养箱( 23-280C ) 、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等6.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及 塞、吸管、薄膜过滤器等6.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、 酒精棉球、 灭菌剪刀、 灭菌镊子、 不锈钢药匙、 试管架、 火柴、记号笔、薄膜过滤膜等6.2 试液6.2.1 消毒液A． 0.1% 新洁尔灭溶液：供手消毒、擦拭操作台面用。

B． 75%乙醇溶液6.2.2 稀释液、试剂及配制A.PH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、 磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白陈1.0g,加纯化水1000ml, 微温溶解，滤清，分装， 1210C 灭菌 15 分钟B.聚山梨酯80C ．吐温80D ．单硬脂酸甘油酯6.3 培养基营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基6.4 操作方法6.4.1 试验前准备6.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、 锥形瓶、 试管、 吸管（ 1ml 、 10ml ） 、 量筒、 稀释剂等移至传递窗内 每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间6.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min 6.4.1.3 操作人员进入一更， 用洗手液或肥皂洗手， 烘干 进入二更，用0.1%新洁尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套6.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封6.4.2 供试液的制备供试液的制备若需用水浴加温时，温度不宜超过450C,时间不得超过30 分钟。

除另有规定外，常用的供试液制备方法如下：6.4.2.1 液体供试品取供试品 10ml ，加 pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液至100ml ，混匀，作为 1:10 的供试液油剂可加入适量的无菌聚山梨酯 80 使供试品分散均匀水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液6.4.2.2 固体、半固体或粘稠性供试品取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白陈缓冲液至100ml,用适宜的方法， 混匀， 作为 1:10 的供试液 必要时加入适量的无菌聚山梨酯80 ，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀6.4.2.3 乳膏剂取供试品 5g （或 5ml ） ，加至含溶化的（温度不超过45℃ ）的吐温80、 3g 单硬脂酸甘油酯、 10g 聚山梨酯 80 无菌混合物的烧杯中，用无菌玻璃棒搅拌成团后，慢慢加入45℃ 的 PH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液至100ml ，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为 1:20 供试液6.4.2.4 栓剂取供试品10g ，加适量稀释液，置45℃ 水浴保温 10 分钟，使溶， 加入无菌聚山梨酯 80 5-8ml ， 振摇使之乳化， 再加稀释液（稀释液和聚山梨酯80 的总量为 100ml） ，摇匀，作为 1:10 的供试液。

6.4.2.5 肠溶制剂取供试品10g,加PH6.8无菌磷酸盐缓冲液至100ml, 45c水浴中，振摇，使溶解，作为 1:10 的供试液6.4.3 供试液的稀释取 1 支 1ml 灭菌吸管吸取1:10 均匀供试液1ml ，加入装有9mlPH7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液的试管中混匀，即为 1:100供试液 （此时操作一般为： 左手执试管并将塞打开、 倾斜， 右手执 10ml 吸管吸量，注意：勿在乙醇灯焰峰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭）以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至 1:1000、 1:*****等适宜稀释级每递增 1 稀释剂，必须另换一支吸管稀释时，吸管插入第 1 级稀释液内不低于液面2.5cm ，反复吸吹约 10 次吸液时，应先吸至高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管， 贴于试管内壁调整液量至刻度， 吸管移至第 2 级稀释管的内壁近液面处（勿接触液面）缓慢地放出全部供试液（吸管内应无黏附或残留液体） 6.4.4 检查法6.4.4.1 平皿法6.4.4.1.1 在进行 10 倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管，吸取每级稀释级供试液各1ml 置每个灭菌平皿中， 每一稀释级每种培养基至少注2〜3个平皿（一般为左手执平皿，将盖半开，右手执吸管） ，注平皿时，将1ml 供试液慢慢全部注入平皿中，管内无残留液体，防止反流至吸管尖端部。

6.4.4.1.2 阴性对照 用 1 支 1ml 吸管吸取试验用稀释液（PH7.0无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液）各1ml,分别注入4个平皿中其中两个作细菌数阴性对照：另两个作霉菌、酯母菌数阴性 对照阴性对照不得有菌生长6.4.4.1.3 倾注培养基将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂，霉菌、酵母菌计数用玫瑰红钠琼脂培养基）熔化，置 45C水浴中，备用将 45 C 左右的琼脂倾注上述各个平皿约 15ml ，以顺时针或反时针方向快速转动平皿 （勿使培养基溢出） 使供试液与培养基混匀，放置，待凝6.4.4.1.4 培养细菌计数平板倒置于 30- 35℃ 培养箱中培养3 天霉菌、酵母菌计数平板倒置于23- 28 ℃ 培养箱中培养5 天，必要时可延长至7 天逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，6.4.4.1.5 菌落计数将平板置观察台上用标记笔点计，以透射光衬以暗色背景，仔细观察，计数必要时借助于放大镜和显微镜观察菌落蔓延生长成片的平板不宜计数 点计菌落数后， 计算各稀释级供试液的平均菌落数， 按菌数报告规则报告菌数 若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于 15，则两个平板的菌落数不能相差 1 倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数； 玫瑰红纳琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数； 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数 在特殊情况下， 若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红纳琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数 然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红纳琼脂培养基上的细菌数， 与玫瑰红纳琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较， 以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果6.4.4.1.6 菌数报告规则细菌、 酵母菌宜选取平均菌落数小于 300cfu 、 霉菌宜选取平均菌落数小于 100cfu 的平板计数，作为菌数报告（取两位有效数字） 的依据 以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g 、1ml 或 10 cO 供试品中所含的菌数 如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于 1时，以V 1乘以最低稀释倍数的值报告菌数6.4.4.2 薄膜过滤法6.4.4.2.1 采用薄膜过滤法，滤膜孔径应不大于 0.45m ，直径约为 50mm 选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响微生物的充分被截留 滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。

使用时， 应保证滤膜在过滤前后的完整性 水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥为发挥滤膜的最大过滤效率， 应注意保持供试品溶液及冲洗液覆 盖整个滤膜表面 供试液经薄膜过滤后， 若需要冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为 100ml 总冲洗量不得超过1000ml ，以避免滤膜上的微生物受损伤6.4.4.2.2 取相当于每张滤膜含1g 或 1ml 供试品的供试液，加至适量的稀释剂中，混匀，过滤若供试品每1g 或 1ml 所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液 1ml,过滤用PH7.0无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红那琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基上培养 每种培养基至少制备一张滤膜滤膜贴于平板上是不得有空隙或气泡，否则影响微生物的生长6.4.4.2.3 阴性对照 取试验用的稀释液1ml 照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照阴性对照不得有菌生长6.4.4.2.4 培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu 6.4.4.2.5 菌数报告规则 以相当于 1g 或 1ml 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以 1 报告菌数（每张滤膜过来 1g 或 1ml 供试品） ，或 1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

6.4.4.3 培养基稀释法取低稀释级供试液 （原液或 1:10供试液或其他供试液） 2份，每份各 1ml ，分别注入平皿中（每皿0.5ml、 0.2ml 或 0.2ml ） ，每1 个平皿倾注培养基约 15ml ，混匀，凝固后，倒置培养，计数每份供试液所加注平板点计的菌落之和，即为每1ml 菌落数， 公的 2 组数据 以两份低稀释级供试液菌落数的平均值乘以稀释倍数报告6.4.4.4 结果报告6.4.4.4.1 菌落数在 100 以内时，按实有数据报告6.4.4.4.2 菌落数大于 100 时， 取两位有效数字报告， 第三位按数字修约规则处理6.4.4.5 复试供试品细菌数、霉菌及酵母菌数其中一项一次检验不合格，应从同一批样品中随机重新取 2 倍包装量供试品， 依法作单项复试两份， 以三次检验结果的均值报告若3 次结果的平均值超过该品种项下的规定，判供试品不符合规定：否则，判供试品符合规定控制菌检查控制菌检查是用于检查某些特定微生物 (控制菌或其他致病菌) ， 按一次检出结果为准， 不再复试 检查时， 按已验证的方法进行供试品的控制菌检查7 大肠埃希菌7.1 设备、仪器及用具7.1.1 设备微生物限度检测室室、 净化工作台、 生化培养箱 ( 30-350C ) 、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。

7.1.2 仪器及器皿显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、 吸管、 注射器、 注射针头、 载玻片、 盖玻片、 薄膜过滤器等7.1.3 用具大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、 酒精棉球、 灭菌剪刀、 灭菌镊子、 不锈钢药匙、 试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等7.2 试液指示液PH7.0无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液、PH6.8无菌磷酸盐缓冲溶液、靛基质试液、革兰染色液、碘液、95%乙醇7.3 培养基胆盐乳糖培。