《动物细胞工程教学》PPT课件.pptx

动物细胞工程(gngchng)教学课件甘肃农业大学生命(shngmng)科学技术学院l主讲(zhjing) 杨志杰第一页，共八十五页第三部分 动物胚胎(piti)工程第二章 动物体外受精(t wi shu jn)技术In vitro fertilization第二页，共八十五页1 概述(i sh)一、概念 是指精子和卵子在体外模拟体内的生殖道环境中完成受精过程(guchng)的技术它的基本原理是在人工模拟体内环境，包括营养、温度、湿度、气体、渗透压、pH等），使卵丘卵母细胞复合体中的初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，完成受精第三页，共八十五页1978年7月25日世界(shji)首例试管婴儿第四页，共八十五页1988年3月10日我国首例试管婴儿(sh un yn r)第五页，共八十五页1992年我国首例三胞胎试管婴儿(sh un yn r)第六页，共八十五页 由于卵子和精子的受精过程是在实验室中完成，故通过这一技术而产下的动物又称为“试管动物”，如“试管牛”、“试管猪”、“试管婴儿”等 该技术包括以下几个技术环节： 卵母细胞体外成熟培养(piyng)（IVM）、体外受精（IVF）和受精卵体外早期培养（IVC） 第七页，共八十五页。

试管动物技术(jsh)体外受精卵子(lunz) 精子 体外 受精卵 早期胚胎 移植 产生后代第八页，共八十五页第九页，共八十五页第十页，共八十五页第十一页，共八十五页不同动物胚胎(piti)移植时间不同桑椹(sn zhn)胚阶段：牛、羊8个或16细胞(xbo)胚阶段：小鼠、家兔4个细胞胚阶段：试管婴儿第十二页，共八十五页 1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚人Austin同时发现了哺乳动物的精子获能现象，这一领域的研究才获得突破性进展 1959年，张明觉以家兔(ji t)为实验材料，从一只交配后12h的母兔子宫中冲取精子(即体内获能的精子)，从另外两只超数排卵处理母兔的输卵管中收集卵子，精子和卵子在体外人工配制的溶液中完成受精过程，并产下15只健康仔兔这是世界上首批试管动物，它们的正常发育标志着体外受精技术的建立二、发展(fzhn)历史第十三页，共八十五页l 目前，采用IVF-ET技术，每对废弃的牛卵巢可获得3头左右(zuyu)的犊牛为充分利用良种母牛的遗传资源，20世纪80年代后期，牛的活体取卵技术（Ovum pick UP.OPU）发展迅速活体取卵和IVF-ET结合已成为欧、美和大洋洲等畜牧业发达国家的农场主为扩大良种母牛群选择的重要繁殖技术。

l 牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段第十四页，共八十五页体外受精技术(jsh)的发展简史动物报道时间报道者兔小鼠大鼠人牛猪恒河猴狒狒绵羊山羊狨猴 马猫犬19591968197419781982198619841984198519851988 199019701976ChangWhittinghamToyodaSteptoeBrackettChengBavisterBamaceda花田章花田章Lopata ZhangHammerMahi第十五页，共八十五页动物卵裂率囊胚率冷冻后存活率鲜胚移植后的产仔率牛羊猪研究(ynji)现状第十六页，共八十五页三、存在(cnzi)的问题和发展方向l1、存在的问题(wnt)l）囊胚发育率低，细胞数少l）产仔率低，胎儿初生重高l2、发展的方向l）深入研究卵母细胞成熟和胚胎发育的分子机理；l）加强腔前卵泡的培养研究，充分利用优良母畜的遗传资源；l）加强体外受精与其他生物技术的结合第十七页，共八十五页四、意义(yy) 1、研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。

2、在家畜品种改良中，体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段，对充分利用优良品种资源，缩短家畜繁殖周期，加快品种改良速度等有重要价值 3、在人类，IVF技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一 4、体外受精技术还是哺乳动物胚胎移植、克隆、转基因和性别控制等现代生物技术不可缺少(qusho)的组成部分 第十八页，共八十五页 国产奶牛：年均(nin jn)产奶量3000公斤左右 国际良种奶牛：年均产奶量10000公斤左右 引进一头良种成年奶牛需要3万5万元； 牛的生育率低，一头牛一胎只生一只，一生只能生育四五次 牛的生育率虽然很低，但是牛的卵母细胞却相当的多，其卵巢中卵母细胞数目要比一生中排卵数多1000倍左右； 公牛产生的精子数目就更多了 从试管(shgun)牛说起第十九页，共八十五页胚胎(piti)移植采集(cij)良种母牛的卵母细胞卵母细胞的体外培养(piyng)采集良种公牛精子精子体外获能体外受精良种牛体外受精胚胎受体牛良种犊牛成熟期牛屠宰加工厂市场采集卵巢中的卵母细胞“试管牛”工厂化生产的技术流程图第二十页，共八十五页2 卵母细胞的体外成熟(chngsh)一、卵母细胞的获取l 在卵母细胞获取技术中，卵泡发育的募集、选择和优势(yush)化，是人工超数排卵和卵母细胞体外成熟的重要基础。

l 卵巢中含有大量的小卵泡，但在每个发情周期中只有部分卵泡能够接受FSH/LH的作用开始发育，这一现象称为募集l 由于促性腺激素的作用，使卵泡细胞雌激素的合成和分泌增加，雌激素通过负反馈作用于下丘脑，控制脑垂体减少FSH的分泌，使其他小卵泡无法接受促性腺激素的作用，结果使卵泡发育闭锁，这一现象称为选择l 卵泡发育到最后阶段，只有少数几个或一个优势卵泡继续发育，这一现象称为优势化第二十一页，共八十五页l 由于雌激素的负反馈作用，促卵泡素水平继续下降，而促黄体素分泌增高，在发情周期的中期促黄体素量达到峰值而激发排卵卵泡排出卵子后，将发育(fy)成黄体，分泌孕酮和少量雌激素，这些激素反馈作用于下丘脑，抑制脑垂体分泌促卵泡素和促黄体素，从而抑制卵泡的发育(fy)l 卵母细胞体外成熟培养时，在培养液中加入促卵泡素活PMSGhCG，能显著提高卵母细胞体外成熟率第二十二页，共八十五页l1、离体卵巢采卵：是从屠宰母畜的卵巢采集卵母细胞l（1）卵泡抽吸法：用注射器针头从卵泡远端抽吸卵泡液l（2）卵巢解剖法（切割法、剥离法）：用手术刀或剪划破卵巢，再悬浮、消化获取卵母细胞l 对卵泡卵母细胞一般采用机械分离法和酶消化法相(f xin)结合，既克服了机械分离时间长和对卵母细胞机械损伤的缺点，又减轻了酶消化过程中对细胞细微结构的破坏。

第二十三页，共八十五页第二十四页，共八十五页刚采集(cij)羊卵母细胞第二十五页，共八十五页刚采集(cij)牛卵母细胞第二十六页，共八十五页培养(piyng)成熟牛卵母细胞第二十七页，共八十五页 2、活体采卵：是从活母畜的卵巢采集卵母细胞 B超引导法：借助超声波(B超)探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞即利用真空泵的负压将卵母细胞及卵泡液吸入离心管 保定母畜、全身麻醉，清除直肠粪便、消毒肛门及外阴 操作员先将带有B超探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上根据B超屏幕所显示的卵泡位置(wi zhi)，利用采卵针穿刺卵泡并同时抽吸卵母细胞 第二十八页，共八十五页科研人员利用注射器将一只1个半月大母羊卵巢中的卵母细胞抽吸(chu x)出来进行体外培养（4月30日摄）新华社记者 张鸿墀 摄 第二十九页，共八十五页镜下检卵镜下检卵第三十页，共八十五页B-超 活 采 仪 B B超活体超活体(hu t(hu t ) )采卵采卵活体(hu t)采集的牛卵母细胞第三十一页，共八十五页第三十二页，共八十五页 借助超声波探头和屏幕的引导，从活母畜卵巢采集卵母细胞操作员先将带有超声波探头和采卵针的采卵器通过阴道插入子宫，同时通过将卵巢贴在探头上。

根据B超屏幕所显示的卵泡位置，利用采卵针穿刺(chunc)卵泡并同时抽吸卵母细胞B B超引导超引导(yndo)(yndo)法法：第三十三页，共八十五页第三十四页，共八十五页卵母细胞的分级(fn j)及筛选A级：卵母细胞周围有3层以上致密(zhm)卵丘细胞，胞质均匀并充满于透明带内；B级：卵母细胞外周有13层卵丘细胞，胞质均匀；C级：卵母细胞的卵丘细胞扩散，胞质不均匀D级：卵母细胞是无卵丘细胞的裸卵，胞质不均匀，有暗斑其中，A级、B级卵母细胞是可用的，C级、D级卵母细胞已经老化，不可用裸卵第三十五页，共八十五页二、卵母细胞的体外成熟(chngsh)（IVC）l1、卵母细胞的成熟(chngsh)过程l 哺乳动物卵母细胞依其生长发育阶段可分为生长期和成熟期人工采集的卵母细胞大都完成了生长，进入成熟期；卵母细胞处于第二次成熟分裂间期而达到中期（M）在光镜下可看到生发泡破裂和第一极体排出；电镜下，线粒体由近核区移向质膜下区，在一端出现大空泡，即帽状线粒体，这是卵母细胞成熟的一个重要标志第三十六页，共八十五页2、卵母细胞体外成熟(chngsh)培养现状 未成熟(chngsh)卵母细胞的体外成熟(chngsh)培养及体外受精在小鼠研究比较深入。

在家畜也取得较大进展，牛、猪等有体外受精仔畜产生但在牛等大家畜卵母细胞IVM/IVF系统存在两个问题，一是IVM/IVF的胚胎发育率较低；二是IVM/IVF培养系统中血清和体细胞的加入使培养液成分复杂化，很难从中分析出影响IVM/IVF的关键因素在猪存在的问题是：多精入卵率高；体外受精卵发育率低第三十七页，共八十五页3、卵母细胞体外成熟的培养(piyng)体系1）培养液：用于卵母细胞体外成熟的最为广泛基础培养液是M199培养时尚要加入一定的血清和激素2）温度和气相：牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞体外成熟培养的温度一般为3839所有(suyu)哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的气相一般要求在含5C02的空气和饱和湿度的环境或5% C02、90%N2、5%O2和饱和湿度3）培养时间： 牛和羊卵母细胞体外成熟培养的时间一般为2224h，而马为3036h，猪为4044h4）培养方法：卵母细胞体外成熟的培养方法一般采用微滴法、封闭法和开放法三种第三十八页，共八十五页4、卵母细胞体外成熟(chngsh)的标志及特征l（1）生发泡破裂l（2）染色体凝集l（3）纺锤体形成l（4）第一极体排出l（5）透明带软化(runhu)l（6）卵丘细胞扩展第三十九页，共八十五页。

5、影响卵母细胞体外成熟(chngsh)的因素动物(dngw)种类 卵母细胞的类型(lixng)卵母细胞和卵泡的大小（1.52mm）卵巢运输和季节（6h，30 ，繁殖季节）（2）培养环境温度时间气相培养基（3）生化因子Ca2+ 甾类激素（LH可诱导卵母细胞成熟，而雄激素和PG则可抑制卵母细胞成熟）卵母细胞成熟抑制因子（1）卵母细胞的来源第四十页，共八十五页6、几种动物(dngw)卵母细胞体外成熟培养的方法（1）小鼠A、培养液：9.4mlTYH液+0.5mlFBS+100IUPMSG或者(huzh)T6液+4mg/mlBSA于当天上午对小鼠皮下注射5IUPMSG， 促进(cjn)卵泡发育；注射PMSG46h后颈椎脱臼法处死小鼠，立即摘出卵巢在表面皿中1.01.5ml的TYH/HEPES液， 在体视显微镜下刺破卵泡选择充分发育的卵母细胞，在石蜡液滴（50100ul/1020个卵母细胞）中培养B、方法第四十一页，共八十五页2）牛、羊A、培养液： TCM199+25mmol/LHEPES+7.5%FBS+0.5mg/L羊FSH+5.0mg/L羊LH+E2+双抗或者TCM199+0.2mmol/L丙酮酸钠+50mg/L庆大霉素+0.5mg/L羊FSH+5.0mg/L羊LH+1.0mg/LE2+0.3%PVPB、方法：从屠宰场获取牛卵巢后，放入2530 DPBS或生理盐水中加双抗的保温瓶中立即带回实验室；从卵巢表面(biomin)吸取28mmCOC；放入石蜡液滴中培养，22。