鼻咽癌差异表达miRNAs筛选研究.doc

1鼻咽癌差异表达 miRNAs 筛选研究作者：李晓霞， 李瑞平， 杜紫明， 曾木圣， 邵建永 【摘要 】 【目的】应用 miRNAs芯片筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达 miRNAs，并寻找差异表达 miRNAs调控的靶基因，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础 【方法】 运用miRNAs芯片技术筛选原代培养的鼻咽癌细胞差异表达 miRNAs，同时运用 miRNAs特异的引物组对差异表达的 miRNAs进行荧光定量 RT PCR验证运用靶基因预测软件并结合全基因组表达谱芯片结果预测差异表达 miRNAs可能调控的靶基因，并利用 western blot技术检测预测的靶基因在原代培养的鼻咽癌细胞中的表达 【结果】 miRNAs芯片结果显示，鼻咽癌中 miR-203、miR-503、 miR-424、miR-141 和 miR-148a表达下调，而 miR-25、miR-195 和 miR-15a表达上调，其差异表达均在 2倍以上；荧光定量 RT PCR结果与 miRNAs芯片的结果较符合；其中 miR-203的预测靶基因为 CCNG1和 SPARC，Western blot结果显示，其在原代培养的鼻咽癌细胞亦高表达。

【结论】 miR-203、miR-503、 miR-424、miR-141、miR-148a 、miR-25 、miR-195、 miR-15a在原代培养的鼻咽癌细胞与正常鼻咽上皮细胞中存在差异表达；CCNG1 和 SPARC可能是 miR-203调控的靶基因，2可能参与了鼻咽癌的发生发展 【关键词】 microRNA； 鼻咽癌； 差异表达Abstract：【Objective】 To investigate the differentially expressed miRNAs and their target genes in primary nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells, which are useful for further studies on functions of miRNAs in pathogenesis of nasopharyngeal carcinoma. 【Methods】 MicroRNA microarray was used to investigate the differentially expressed miRNAs in primary NPC cells, and the discovered miRNAs were confirmed by real time RT-PCR assay. Furthermore, we predicted the possible target genes by combination anticipated algorithms and the whole expression profile of genome from primary NPC cells. Western blot was performed to detect the expression of the predicted target gene in primary NPC cells. 【Results】 MicroRNA microarray showed that expression of miR-203, miR-503, miR-424, miR-141, and miR-148a were down-regulated in primary NPC cells by two folds, while expression of miR-25, miR-195, and miR-15a were up-regulated by more than two folds too, which was accordant with the results from real time RT-PCR. CCNG1 3and SPARC, the predicted target genes of miR-203, were detected to be high expressed in primary NPC cells by Western blot assay. 【Conclusion】 MiR-203, miR-503, miR-424, miR-141, miR-148a, miR-25, miR-195, and miR-15a were differentially expressed between NPC and NPNE cells. CCNG1 and SPARC, the putative target genes of miR-203, may play an important role in the pathogenesis and development of NPC.miRNAs (microRNA)是一类高度保守的非编码小 RNA（nod-coding small RNA） ，一般为 19～25nt 的单链型 RNA，由60～110nt 的可形成发夹状的内源性转录前体加工而成。

它们广泛存在于植物、动物以及病毒中[1]miRNA 与靶 mRNA的 3’UTR碱基配对，通过抑制 mRNA的翻译[2]或直接使 mRNA降解[3]，在转录后水平使基因产生沉默越来越多的证据显示由 miRNA调节的基因调控机制作为基因表达水平调控的一种重要方式，与肿瘤的发生密切相关，miRNAs 很可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因对慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的研究发现 mir-15a和 mir-16-1位于 13q14染色体缺失域，50%～60%的 CLL的患者存在 mir-16-1和/ 或 mir-15a的表达下调[4]，而 miR-143和 miR-145在结肠癌中表达下调 [5]，Let-7 在肺癌细胞中表达下调，RAS 可能受到 Let-7的调控[6]，并且 50%4以上的 miRNAs的基因位于在人类癌症中发生缺失、扩增的染色体区域或染色体脆性位点，进一步表明了 miRNAs与人类癌症的相关性[7]鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是我国南方地区常见的恶性肿瘤目前认为，遗传因素、EB 病毒感染和某些环境因素与鼻咽癌的发生有关[８] ，但具体的分子发生机制尚不清楚。

本研究应用 miRNAs芯片筛查了原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞差异表达的 miRNAs，并在对差异表达的 miRNAs进行靶基因的预测的基础上进一步对其靶基因进了行验证，为进一步研究其在鼻咽癌发病机制中的作用打下基础1 材料和方法1.1 材 料5例原代培养鼻咽癌细胞（NPC8、NPC31、NPC43、NPC44和 NPC47）及 5例原代培养鼻咽正常上皮细胞（NPNE5、NPNE7、NPNE10、NPNE12 和 NPNE13）标本均来源于中山大学肿瘤防治中心鼻咽科门诊患者均为未接受过治疗的门诊病人鼻咽癌细胞株 C666由中山大学附属肿瘤防治中心实验研究部冻存1.２ 方 法51.２.1 细胞培养 鼻咽原代细胞的培养方法参见文献[１]，其中用于芯片的鼻咽原代细胞均经过生物学特性的鉴定（资料未发表） C666细胞用 RMPI 1640培养基（含有 10%的 FBS、50 mg/L 链霉素和 50 mg/L青霉素） ，细胞置于 37 ℃，5%CO2 的培养箱中1.２.２ 小分子 RNA样品的分离与荧光标记 取对数生长期细胞，Trizol一步法提取细胞总 RNA，异丙醇沉淀法浓缩 RNA，分光光度计测定总 RNA的纯度，甲醛变性胶电泳质检总 RNA的质量。

取 50～100 μg总 RNA用 miRNA Isolation Kit分离小于 100 nt的小分子 RNA，具体方法按说明书进行1.２.３ miRNA芯片杂交及数据分析 芯片由北京博奥生物芯片有限责任公司研制（晶芯?誖哺乳动物 miRNA微阵列芯片服务V1.0芯片上一共有 509个 miRNA对应的探针） miRNAs 芯片杂交、扫描和数据分析均在该公司技术服务部完成，详细资料见网站（）1.2.4 生物信息学分析 应用互联网上 miRNA靶基因预测软件（Pictar[9] 、Targetscan[10]、MiRbase[11]、MiRanda[12]）服务站点，输出差异表达 miRNA的预测靶基因，取至少 3个软件预测到的基因作为靶基因61.2.5 荧光定量 RT-PCR miRNA的 RT PCR方法参照 Chen等[13]的方法相应的 PCR引物见表 1采用 U6 RNA作为内标，进行归一化1.2.6 Western Blot分析 分别取 2例鼻咽癌原代细胞（NPC43， NPC44）和 1例鼻咽正常上皮原代细胞（NPNE5）Trizol 提取 RNA后的剩余液，按照 Trizol试剂说明书提取蛋白，-80 ℃保存待用。

鼠抗人 SPARC 单克隆抗体；兔抗人 CCNG1多克隆抗体均购自 DAKO公司2 结 果2.1 总 RNA提取及质量鉴定结果样品总 RNA的 OD260 /OD280之值在 1.8～2.0 之间甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，条带清晰，28 S比 18 S RNA条带亮度接近 2 ∶ 1，RNA 完好无降解，质量符合 miRNAs芯片的质量要求(图 1)经 miRNA Isolation Kit分离，分别获得 C666、 5例鼻咽癌原代细胞（NPC8、NPC31、NPC43、NPC44 和 NPC47）及 5例正常鼻咽上皮原代细胞（NPNE5、NPNE7 、NPNE10、NPNE12 和NPNE13）的小分子 RNA72.2 鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞差异表达 miRNA分别将 NPNE7和 NPNE10，NPNE5、NPNE12 和 NPNE13样本小 RNA混合后与芯片杂交，NPC8、NPC31、NPC43、NPC44 和 NPC47样本小 RNA分别与芯片杂交杂交芯片经过扫描和数据整理后应用 Cluster和 SAM软件输出，得到 miRNA表达谱和差异表达 miRNA（表 2） 应用非监督等级聚类（unsupervised hierarchical clustering）的方法将原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞的 miRNA放到一起聚类，得到原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞 miRNA表达谱（图 2） 。

结果显示在原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞中 let-7家族、miR-29、miR-23、miR-24、miR-22 和 miR-221等高表达应用SAM软件 two class unpaired的方法筛选出 24个鼻咽癌相关miRNAs，包括 18个在鼻咽癌表达下调的 miRNAs和 6个在鼻咽癌表达上调的 miRNAs其中在鼻咽癌表达下调 2倍以上的有：miR-203、miR-503、miR-424、miR-141 和 miR-148a共 5个在鼻咽癌表达上调 2倍以上的有：miR-25、miR-195 和 miR-15a共 3个2.3 差异表达 miRNA的 RT-PCR验证结果采用荧光定量 RT-PCR的方法检测了芯片中显示表达下调的8miR-203在几个原代培养的鼻咽癌和正常鼻咽上皮细胞中的表达，同时对表达上调的 miR-195，miR-25，miR-15a 在 NPC47的表达进行了检测，并采用 U6进行归一化miRNAs 定量 PCR扩增曲线和溶解曲线(图 3)，显示溶解曲线呈单峰，引物的特异性较好我们又将芯片结果与。