《植物发根培养》ppt课件.ppt

植物发根培养,导师：虞星炬 研究员 张 卫 研究员 学生：曲均革,Seminar II,植物是自然界中最好的化工厂 目前超过100，000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约4，000种新化合物的速度增加 植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等,植物次生代谢物的获得,直接从野生植株中分离提取 植物细胞培养 优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地 缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化 植物发根培养,内容纲要,什么是发根？ 发根培养的特点、优点 发展历史 发根农杆菌的生物学特性及致病机理 发根的诱导及培养 研究现状、存在问题、解决办法,什么是发根？,发根（hairy root）是发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，其Ri质粒上的T—DNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型（形成多分枝的、生长迅速的不定根）,发根培养的特点、优点,生长迅速 激素自养 分化程度高 遗传性状稳定 稳定性和生长迅速的特点是工业化生产梦寐以求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的 很多次生代谢产物仅在特定的器官或组织中形成，即只有分化才伴随次生代谢过程的进行，发根中含有相应的次生代谢物含量明显比培养的细胞高 近三分之一传统药材的药用部位是根，发根培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义,发展历史,1934年，Hildebrand报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根，自此开始对其致病机理进行研究，并与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）一起作为基因工程的载体 80年代后期，发根培养技术应用在植物次生代谢物生产上,发根农杆菌的生物学特性,发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） ：土壤细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 Ri质粒（root inducing plasmid）：T－DNA区、Vir区两个功能区 T－DNA区插入到寄主植物基因组中，表达决定发根生长和冠瘿碱合成的基因，冠瘿碱的检测是评价植物转化是否成功的证据之一 Vir区不插入寄主植物基因组DNA中，但与T－DNA的转移有关，其缺失或突变不能使感染的植物出现发根,,Ri质粒,Ri质粒感染过程,发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导Ri质粒的Vir区基因群活化； 在Vir区基因表达产生的酶作用下T－DNA被切下； T－DNA转移进细胞并整合到植物基因组DNA中； T－DNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根,发根的诱导及培养,发根农杆菌感染植物的方法 向植物体直接注射 对植物外植体进行接种感染 与原生质体共培养 发根的筛选及增殖培养 含抗生素的培养基上继代培养除菌 选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长 一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖2500～5000倍）,发根的鉴定,形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 组织水平：GUS活性的测定或NPTII酶的检测 细胞水平：冠瘿碱的测定 分子水平：Southern Blot方法,影响发根农杆菌转化的因素,菌株 常用菌株：LBA9402，ATCC15834，R1601，TR105，A41027，A42659 植物及外植体 对Ri质粒的敏感性：双子叶植物单子叶植物，草本植物木本植物 在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植体 将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根诱导率的变化 理化因子的影响 水溶性酚 ：乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚 ，激活Vir区基因表达 光照 其它 感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等,影响发根培养及次生代谢物合成的因素,培养基 基本培养基、碳源、氮源 植物激素 发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响 pH值 前体 诱导子 刺激代谢物的产生和分泌,培养方法 固体培养 液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养 两步培养法 两相培养法 反复成批培养 补料成批培养 生物反应器 发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要 通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器,影响发根培养及次生代谢物合成的因素,发根生物反应器结构及其培养系统的研究主要集中在： 一是尽可能减低机械剪切力对发根的损伤（减少搅拌）； 二是提高气液传质速率，增加溶氧量,研究现状,人参（Panax ginseng）：在无外源激素的条件下，发根生长速度为用激素诱导根的2倍，人参皂甙（Rb和Rg）含量最高可达干重的0.95％ 长春花（Catharanthus roseus）：从发根中检测到细胞培养中一直未能得到的长春碱和长春新碱 亲本植株能合成的次生代谢物都可用发根培养生产 发根培养是利用生物技术生产次生代谢物的新的有效途径,存在的问题及措施,有些植物发根难诱导，各转化系统相对独立，无模式系统 大量筛选菌种，采用合适的外植体，综合利用各种理化因子 有些发根生长不太快，有些难以维持正常的形态，常出现脱分化形成愈伤组织或分化出幼苗、胚状体等现象，致使生产能力下降、培养失败 采用合适的培养方法，必要时调节营养及激素水平，使发根维持正常的形态及快速生长和次生物质生产能力 难以大规模培养 选用通气性能良好且无机械搅拌的反应器 采用两相培养法或在培养基中加入诱导子使代谢物分泌到培养基中并及时收集，以减少其对生长的不利影响,。