分子生物学电子教案第六章.doc

第六章遗传重组1．课程教学内容 (1) 同源重组 (2) 位点特异性重组 (3) 转座重组 (4) 逆转座子 2．课程重点、难点 几种重组的机理 3．课程教学要求 （1）理解重组产生的遗传效应； （2）掌握不同重组产生的机理 一、概述 重组是完整DNA分子的断裂和重接 1930年，细胞学观察：染色单体断裂，重接，发生交换1955年，遗传学家发现交换可以发生在基因内部，推测重组是在复制时发生的，拷贝选择（copy choice）结论：重组是DNA分子断裂后重新连接形成的更进一步研究证明末复制的DNA分子也可以发生重组遗传重组 广义地说，任何造成基因型变化的基因交流过程都称为遗传重组狭义上的遗传重组指涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流根据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求，可以分为四类包括：– 同源重组（homologous recombination） – 位点专一性重组（site -specific recombination） – 转座重组（transposition），被移动的DNA片段叫转座子（transposon） – 异常重组 同源重组 发生在DNA的同源序列之间。

真核生物非姊妹染色子体的交换、细菌及某些低等真核生物的转化、细菌的转导、接合、噬菌体的重组都属于这种类型大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白 位点特异性重组 发生在两条DNA的特异性位点上，λ噬菌体DNA通过其attp位点和大肠杆菌DNA的attB 之间的位点特异性重组而实现整合过程转座过程中，转座成分从染色体的一个区段转移到另一个区段或从一条染色体的转移到另一条染色体转座作用既不依靠转座成分和插入区段的同源性，又不需要RecA蛋白质由于转座作用总是伴随着转座成分的复制，故又称为复制重组异常重组不需要DNA序列的同源性和RecA蛋白质，而且它也不需要转座酶二、同源重组的机制同源重组的行为本身是DNA序列的交换：两个同源的DNA双螺旋分子相互接近，接触，然后有关的部分发生交换它的特征是任意一对同源系列都可以作为底物由有关的酶催化重组这些酶对DNA无碱基序列的特异性，只要两个DNA序列相同或接近相同，就可催化重组同源重组发生在染色体上具有相同或相近序列的DNA区域重组的起动需要DNA分子上有断裂或缺口 事实表明，DNA断裂能够大大提高重组率因此紫外照射、X光和一些能够使DNA断裂的化学物质可大大提高重组率。

在大肠杆菌中， DNA 聚合酶Ⅰ和连接酶基因的突变也有同样作用酵母整合载体，若是线状则可提高整合率1000倍RecA 蛋白使单链DNA与染色体上互补序列配对 RecA蛋白:– 依赖于DNA的水解三磷酸核苷的功能– 在两条互补的单链间促进配对的功能– 依赖于ATP和寡聚核苷酸的蛋白水解酶的Rec A蛋白能专一性地识别单链DNA，使它与同源染色体双链DNA的互补序列退火，替换原来的互补链Rec A蛋白以一定比例与单链DNA结合，一般1个蛋白多肽5个核苷酸，形成DNA-蛋白丝在ATP存在时，Rec A可使双链解旋，形成新的杂种DNA在有些噬菌体，如T7和λ噬菌体中，仅有核酸酶和SSB，随机碰撞可重组高等生物的重组需要Rec A蛋白 Rec BCD和其它蛋白在重组中的作用 若没有Rec BC，在细菌接合过程中重组率可降低100倍，这种复合酶大约300kd，具有DNA解旋和核酸酶的活性它可以帮助有游离末端的DNA形成单链DNA片段，从而有利于RecA 蛋白作用它识别并切割Chi序列：5GCTGGTGG-3在大肠杆菌接合过程中易形成双链DNA游离末端，在P1噬菌体转导和λDNA侵染的细胞中RecBC对重组率影响极大。

一种核酸酶切开霍利迪结合点，从而完成重组霍利迪结构 它是DNA重组过程中的一个中间体，重组时两个DNA双链体以四股DNA在连结点形成的十字形DNA分子构象异源双链体 (Heteroduplexes)：异源双链体是指重组DNA分子上两条链不完全互补的区域分支迁移（Branch migration）：一旦两个重组的DNA分子形成霍利迪结构，交叉连接点很容易像拉链一样移动，从而扩大异源双链体区域，这一程 叫分支迁移三、位点专一性重组是指噬菌体基因组插到细菌的染色体中，这个过程也叫整合（integrate），需要噬菌体DNA与细菌DNA的专一序列 在位点专一性重组中没有DNA的合成，每条DNA链上的断裂和重接十分精确 λ噬菌体的整合和解离 λ 噬菌体：裂解周期和溶源化周期 附着位点（attachment site，Att）：大肠杆菌23bp；噬菌体 240bp，相同的核心序列 整合需要整合酶(integrase，int)和一种细菌蛋白integration Host factor(IHF)；解离需要Xis gene产物，int和IHF 在溶源lysogenic周期中，噬菌体λ DNA是细菌染色体的一个整合部分，成为原噬菌体prophage。

在裂解lytic周期中，λDNA以独立的环状分子存在于被侵染的细菌中两种状态的改变就包括了位点专一性重组要进入溶源状态，游离的λDNA必须被整合(integrate)进寄主DNA；要从整合的溶源状态释放，进入裂解状态，原噬菌体DNA必须从染色体上剪切下来excise整合作用 整合与剪切发生在噬菌体和细菌的特殊位点上，这个位点叫附着点attachment site（att）细菌的位点叫attB，由BOB’组成噬菌体的位点叫attP，由POP’组成序列O是att B和att P的共同序列，叫核心序列core sequence，重组就发生在这里侧翼的序列B、B’、P、P’是臂，序列各不相同原噬菌体由重组产生的新位点界定左边的位点叫att L，由BOP’组成，右边的位点叫att R，由POB’组成整合作用发生在att B和att P之间（att Batt P），而剪切作用发生在att L和attR之间（att LattR），四、转座子重组（Recombination via transposon） 重组不依赖DNA的序列，使一段DNA序列从染色体的一个位置移动到另一个位置，甚至从一个染色体移动到另一个染色体，这种重组叫转座重组（transposition），被移动的DNA片段叫转座子（transposon）。

转座子（ 或transposalole elements）：可以转移到新位置的DNA序列 转座因子可以直接或间接造成基因组重排： ① 直接造成缺失一倒位或序列移位② 作为小的同源区域在细胞同源重组体系作用下，相互重 组造成缺失、插入、倒位和易位(translocation)1 细菌中的转座重组简单转座子、复合转座子、转座的机制、TnA家族的转座子1）简单转座子• 最简单的转座子就叫插入序列(Insertion sequences ,IS ) λ:IS1表示IS1插入λ噬菌体的基因组 • IS序列可以编码自己转座所需的转座酶.IS两端带有反向重复序列，中间是一个转座酶基因，不带其它标记基因 • 在IS 转座时，插入位点的DNA序列重复了(正向重复)不同IS插入位点不同，但重复序列大多为5-9bp • 每个插入序列的末端都是短的反向末端重复序列inverted terminal repeats，两个反向末端重复序列往往很相似但不一定相同不同IS序列转座率不同，一般每代为10-3—10-4 • 转座完成后，靶位点形成两个拷贝，位于转座子的两端，形成同向重复序列direct repeats。

2）复合转座子Composite Transposons • 有些转座子除了与转座有关的功能外，还带有抗药性或其它标记，这些转座子命名为Tn加数字复合转座子是一种大的转座子，中间区带有抗药标记，两边各带一个由IS因子组成的臂，这两个臂可以是同向或反向的　 • 由于IS序列成为复合转座子的一个组成部分，所以又把IS序列称为IS元件module因为每个元件都有一对反向末端重复，所以整个复合转座子的末端也是反向重复序列• 转座使靶位点加倍• Tn5的两个边界IS50R序列只差一个碱基，IS50R是有功能的，IS50L无转座功能3）TnA家族的转座子• Tn A家族的转座子不与IS元件复合，只含有长度为37－38bp的反向末端重复• 这类转座子在靶位点上产生5bp的同向重复• TnA家族转座子的运动需要转座 酶的作用，解离需要一个特殊解离位点，这是TnA家族的特征• 这类转座子含有3个基因，beta-内酰胺酶，解离酶，转座酶 4）转座子的转移机制 　①　转座子能够精确的转座，带着在原来位置上的所有DNA序列，而不带任何相邻序列，这可能就涉及到转座酶能够准确地识别两个转座子的末端 ②　在目标DNA的位置有3-12 个碱基(决定于转座子)被精确地复制了，在转座子两端各有一个拷贝。

所以，在转座子过程中一定有DNA的合成③　虽然大部分转座子可插入基因组任何区域，但它们的移动也不是完全随机的，而是更易于插入某些区段5）转座作用的遗传效应 • 转座引起插入突变 各种IS, Tn 都可以引起插入突变• 转座产生新基因 如果转座子上带有抗药性基因，它一方面造成靶DNA序列上的插入突变，同时也使这个位点带有抗药性• 转座产生染色体畸变 当复制性转座发生在缩主染色体DNA原有的位置附近时，往往导致转座子两个拷贝的重组，引起DNA的缺失和倒位当重组发生在两个正向重复转座区之间，就导致宿主染色体缺失如果重组发生在两个反向重复转座区，则引起染色体DNA 倒位 • 转座引起生物的进化 6）转座子转座的特征 • 转座不依赖于靶序列的同源性 • 转座后靶序列重复 • 转座子的插入具有专一性 • 转座子具有排它性 • 转座具有极性效应 • 活化邻近的的沉默基因 • 区域性优先 2真核生物中的转座 1）玉米的转座子 四十年代玉米遗传学研究发现，在体细胞分裂过程中所发生的变异是由一些控制因子(controlling elements)决定的，这些因子可以从一个位置移动到另外一个位置。

这些控制因子是由McClintock 鉴定的，现在都可以认为是转座子• 自主成分autonomous elements：它们具备使自身切除或转座的能力，它们可在任意位点插入并产生不稳定的或可变化的等位基因• 非自主成分nonautonomous elements：它们只有在同家族的自主成分存在时才能切除或转座，它们自身很稳定，不能单独移动非自主成分由自主成分衍生而来，当自主成分丢失了某些对转座必需的功能后，就形成了非自主成分玉米有几组不同的控制因子，每组又都有自主型和非自主型（autono。