正交试验-多指标归一化法优化凤丹皮水提工艺.docx

    正交试验多指标归一化法优化凤丹皮水提工艺    王培　赵宏苏　吴德玲　许凤清　张伟　龙全江　方成武R284.2 文献标志码 A 1001-0408（2018）03-0361-04DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.03.17摘 要 目的：优化凤丹皮水提工艺方法：采用L9（34）正交试验设计，以凤丹皮中8个成分没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍藥苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚的峰面积百分比和浸膏率经归一化法后的综合评分为考察指标，对凤丹皮水提工艺的药材浸泡时间、料液比、提取时间、提取次数进行优化，并进行验证试验结果：最优水提工艺为加20倍水，浸泡药材1 h，提取2次、每次2 h验证试验结果中，3次试验的综合评分分别为65.98、68.85、69.25，各指标的RSD均小于5%（n=3）结论：建立的综合评分方法能较全面地反映凤丹皮的相对有效成分含量，以此优化得到的提取工艺合理、可行Key 凤丹皮；多指标；归一化法；正交试验；提取工艺；优化ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize water extraction technology of Feng-Moutan Cortex. METHODS： L9（34） orthogonal design was used to optimize soaking time， solid-liquid ratio， extraction time and extraction times in water extraction technology of Feng-Moutan Cortex using comprehensive scores for the peak area percentage and extract yield of 8 ingredients in Feng-Moutan Cortex as gallic acid， paeoniflorin， catechin， paeoniflorin， benzoic acid， benzoyloxypaeoniflorin， benzoylpaeoniflorin and paeonol after normalization as indexes. Verification test was conducted. RESULTS： The optimal water extraction technology was that 20-fold water， soaking for 1 h， extracting twice， 2 h each time. Results of verification test showed that comprehensive scores of 3 times of tests were 65.98， 68.85 and 69.25， respectively. RSDs of each index were lower than 5% （n=3）. CONCLUSIONS： Established comprehensive scoring method can reflect the relative contents of effective components in Feng-Moutan Cortex comprehen- sively， so that optimized extraction technology is reasonable and feasible.KEYWORDS Feng-Moutan Cortex； Multiple-index； Normalization method； Orthogonal test； Extraction technology； Optimization牡丹皮为毛茛科植物牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀之功效，主要用于温毒发斑、吐血、夜热早凉、无汗骨蒸、经闭痛经等症状[1]。

牡丹皮在我国主要分布于安徽铜陵、南陵、亳州、青阳，重庆垫江，甘肃榆中以及四川、山东、陕西、湖南等地传统认为铜陵凤凰山、南陵丫山为丹皮的道地产区，该产区牡丹皮被称为凤丹皮[2]本研究以道地药材凤丹皮为研究对象，采用正交试验设计凤丹皮水提工艺，选定没食子酸、氧化芍药苷、儿茶素、芍药苷、苯甲酸、苯甲酰氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、丹皮酚等8个成分的面积百分比和浸膏率为评价指标[3]，采用峰面积归一化法对多指标的正交试验结果进行评分，筛选最优水提工艺1 材料1.1 仪器ACQUITY UPLC H-CLASS超高效液相色谱系统，包括四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower3 色谱工作站（美国Waters公司）；PALL Cascada II.I超纯水一体化系统[颇尔过滤器（北京）有限公司]；WL-100打粉机（瑞安市威力制药机械厂）；EX125DZHW十万分之一天平（美国奥豪斯仪器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海光都仪器设备有限公司）；HH数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）1.2 药材、对照品与试剂凤丹皮于2016年10月采自铜陵凤凰山，经安徽中医药大学药学院刘守金教授鉴定为毛茛科植物4年生牡丹的根皮；没食子酸（批号：GZDD-0128）、儿茶素（批号：GZDD-0073）、芍药苷（批号：0736-200015）、苯甲酰氧化芍药苷（批号：GZDD-1655）、苯甲酸（批号：GZDD- 0182）、苯甲酰芍药苷（批号：GZDD-0758）对照品均购于贵州迪大生物科技有限责任公司，纯度均大于98%；氧化芍药苷对照品（批号：16021505，纯度：99.93%）由北京恒元启天化工技术研究所提供；丹皮酚对照品（安徽中医药大学天然药物化学实验室制，批号：2016-11，纯度：>99%，经峰面积归一化法计算）；乙腈、甲醇、甲酸均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果2.1 药材的前处理凤丹皮药材采集后清洗去除泥沙，除去细根，剥取根皮，晒干，于48 ℃以下干燥[4]，粉碎，过4号筛备用2.2 多成分峰面积百分比测定方法的建立2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定各对照品没食子酸4.02 mg、氧化芍药苷5.05 mg、兒茶素1.47 mg、芍药苷5.53 mg、苯甲酸2.93 mg、苯甲酰氧化芍药苷1.76 mg、苯甲酰芍药苷1.01 mg、丹皮酚2.47 mg，分别加入50%甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，制成对照品贮备液精密吸取各对照品贮备液适量，置于10 mL量瓶中，制成上述8种成分质量浓度分别为40.2、50.5、28.4、110.6、58.6、35.2、22.0、123.5 ?g/mL的混合对照品溶液2.2.2 供试品溶液的制备 取凤丹皮药材粉末10 g，精密称定9份，根据正交试验进行回流提取，每次提取后过滤，合并滤液，定容至100 mL量瓶中吸取5 mL，用甲醇定容至25 mL量瓶中，摇匀，用0.22 ?m微孔滤膜滤过，即得各提取液的供试品溶液另量取提取液50 mL经浓缩后真空干燥至恒质量，称取浸膏量，供测定浸膏率用2.2.3 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相：乙腈（A）-0.02%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～1 min，8～15%A；1～8 min，15%～18%A；8～10 min，18%～30%A；10～15 min，30%～35%A；15～20 min，35%～85%A）；流速：0.15 mL/min；进样体积：2 μL；柱温：30 ℃；检测波长：230 nm。

按上述色谱条件，取“2.2.1”“2.2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液（正交试验中7号）进样分析，结果各成分色谱峰及与相邻峰间的分离度均大于1.5色谱图见图12.2.4 精密度试验 取凤丹皮10 g，精密称定按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，记录色谱图结果，各成分峰面积的RSD均小于2.75%（n=6），表明本试验精密度良好2.2.5 重复性试验 取同批凤丹皮药材6份，每份10 g按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图结果，各成分峰面积的RSD均小于3.03%（n=6），表明本试验重复性良好2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液（正交试验7号），分别在放置0、2、4、8、10、12、24 h进样测定结果，各成分峰面积的RSD均小于2.33%（n=7），表明供试品溶液在24 h内稳定2.3 正交试验凤丹皮优化水提工艺2.3.1 因素与水平 采用L9（34）正交试验对凤丹皮水提工艺进行优化[5-6]经前期预试验后，选择水提工艺的4个影响因素：药材浸泡时间（A，h）、料液比（B，g/mL）、提取时间（C，h）及提取次数（D）进行考察，建立4因素3水平表，详见表1。

2.3.2 指标计算 将8个成分峰面积百分比（各成分峰面积占有效成分总峰面积的百分比）的权重系数分别设定为10，浸膏率权重系数设定为20，各项指标通过百分制评价[7-8]，归一化处理后，得到综合评分（Pj）归一化方程[9]为：Rij=（Fij-Fimin）/（Fimax-Fimin）式中，Rij为第i个指标、第j次试验的峰面积百分比归一化值；Fij为第i个指标、第j次试验峰面积百分比；Fimax、Fimin 为第i个指标峰面积百分比的最大值和最小值；i为评价指标，i=1、2、3…… 8，j为试验次数，j=1、2、3……9Ej=（Nj-Njmin）/（Njmax-Njmin），式中Ej为浸膏率的归一化值，Nj表示第j次试验中的浸膏率Pj=10× [∑][i=1][j=8]Rij+20×Ej2.3.3 试验方案与结果 选择L9（34）正交试验，采用多指标归一化-加权法对数据进行处理，各试验中8个成分峰面积百分比及浸膏率测定结果见表2，正交试验方案及综合评分结果见表3，方差分析结果见表4由表3、表4可见，各因素影响大小依次为B>C>A>D，即料液比>提取时间>药材浸泡时间>提取次数方差分析结果显示，料液比在凤丹皮提取过程中有显著影响。

由结果来看，虽以A2B2C3D3为最优组合，但D因素的第2、3水平之间的差距较小，即增加提取次数也不会大幅度地提高指标得分，反而只会增加能耗、浪费时间，故从经济环保、节约成本的方面考虑，最终确定凤丹皮的最优水提工艺为A2B2C3D2，即药材浸泡1 h，加入20倍体积的水，提取2次、每次2 h2.4 验证试验称取凤丹皮药材3份，每份精密称定100 g，置于圆底烧瓶中，加入2 L纯水，浸泡1 h，加热回流提取2次，每次2 h结果，3次试验8个成分峰面积百分比及浸膏率的RSD均小于5%（n=3），表明优化的水提工艺可行、稳定，结果见表53 讨论凤丹皮中含有多种化学成分，其主要化学成分为酚及酚苷类、单萜及其苷类、有机酸类、黄酮类等[10-11]其中丹皮酚属于酚及酚苷类，芍药苷、氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷属于单萜及其苷类，没食子酸、苯甲酸属于有机酸类，儿茶素属于黄酮类药理研究发现：酚及酚苷类中的丹皮酚具有降血糖、抗炎、抗过敏及免疫调节等作用，单萜及其苷类中的芍药苷具有抗血小板聚集、降血压、调节血脂、镇静、镇痛、抗炎等作用有机酸类成分具有抗炎、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[12-13]，黄酮类成分具有抑制酪氨酸酶、高级糖化物终末产物（AGES）的产生等作用[14]。

目前在牡丹皮提取工艺研究中，有的选取丹皮总酚作为指标性成分，有的选。