实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝课件.ppt

实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝lTriton X-100 (Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚聚乙二醇辛基苯基醚) )作用：作用： 非离子去垢剂非离子去垢剂 适当浓度的适当浓度的Triton X-100Triton X-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存；胞质中的细胞骨架系统可被保存；lM M－缓冲液－缓冲液 和磷酸缓冲液作用和磷酸缓冲液作用: :　　　　 清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压；lEDTAEDTA（乙二胺四乙酸）和（乙二胺四乙酸）和EGTAEGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：（乙二醇双醚四乙酸）作用： 前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合CaCa2 2＋＋，主要是，主要是高浓度的高浓度的CaCa2 2＋＋可是微管解聚，因此加入可是微管解聚，因此加入EGTAEGTA来降低来降低CaCa2 2＋＋的浓度；的浓度；l戊二醛作用：戊二醛作用： 良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态；l考马斯亮兰作用：考马斯亮兰作用： 非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）。

非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝l实验的关键：实验的关键： Triton X-100 Triton X-100 抽提处理的时间很关键，如抽提处理的时间很关键，如果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝一、实验目的一、实验目的l掌握观察植物细胞内微丝的方法掌握观察植物细胞内微丝的方法l了解观察动物细胞内微丝的方法了解观察动物细胞内微丝的方法实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝二、实验原理二、实验原理l细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维它们对细胞形态的维持、细胞的生长、中间纤维。

它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用l光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1 1％％Triton X-100Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250R250染染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝细胞骨架细胞骨架微管微管微丝微丝中等纤维中等纤维实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝三、材料和试剂三、材料和试剂l材料：新鲜洋葱鳞茎材料：新鲜洋葱鳞茎l器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸l试剂：试剂： 0.2mol/L 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（ pH6.8 pH6.8），）， 1 1％％ Triton X-100 Triton X-100（用（用M-M-缓冲液配制），缓冲液配制）， M-M-缓冲液，缓冲液， 3%3%戊二醛（用戊二醛（用0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制），磷酸盐缓冲液配制）， 磷酸缓冲盐溶液（磷酸缓冲盐溶液（PBSPBS，，pH6.8pH6.8），）， 0.20.2％考马斯亮兰％考马斯亮兰R250R250实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤l1. 1. 取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表皮取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表皮作对照，大小作对照，大小1 1㎝㎝2 2，放入盛有，放入盛有0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液[PBS][PBS]（（pH6.8pH6.8）的青霉素瓶中；）的青霉素瓶中；l2. 2. 吸去缓冲液，加入吸去缓冲液，加入1 1％％ Triton X-100 Triton X-100处理洋葱内表处理洋葱内表皮皮20-30 20-30 ？？minmin；；l3. 3. 吸吸Triton X-100Triton X-100，用，用M-M-缓冲液缓冲液充分清洗充分清洗3 3次，每次次，每次3min3min；；l4. 4. 用用3%3%戊二醛戊二醛固定固定20min20min；；l5. 5. 用用[PBS][PBS]清洗清洗3 3次，每次次，每次10min10min；；l6. 6. 0.20.2％考马斯亮兰％考马斯亮兰R250R250染色染色20-30min20-30min；；l7. 7. 用用蒸馏水蒸馏水清洗清洗1-21-2次；次；l8. 8. 压片，镜检。

压片，镜检l结果微丝束呈深蓝色结果微丝束呈深蓝色实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝五五 、实验结果、实验结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数10×20））左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层实验七细胞骨架的观察考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝。