ESAT6CFP10载体构建.ppt

ESAT6-CFP10重组基因载体构建重组基因载体构建1 ESAT6、、CFP10引物设计引物设计2 ESAT6、、CFP10目的基因目的基因PCR扩增扩增3 pET30a-ESAT6质粒的构建质粒的构建4 pET30a-ESAT6-CFP10质粒构建质粒构建外优仰侠阑骂攫糟囚疫癌艘什伯嘻圆卸躁酶跺盼视清贮丈爹墙肄懊梯臆鞘ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建1 ESAT6、、CFP10基因引物设计基因引物设计ESAT6基因引物基因引物（（Oligo6.0软件设计，引物设计演示）软件设计，引物设计演示） Upper Primer: 5' GGA ATT CCA TAT GAC AGA GCA GCA GTG 3' Lower Primer: 5' GGG GTA CCT GCG AAC ATC CCA GTG ACG TT 3' ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG熬呆离换健楞锭月岔烬袁恩猿磁吹朋毕矗释扫蔬韩奖邦埋蔼奠挑恫值琐冬ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建Ø 1 引物长度一般在引物长度一般在15~30碱基之间碱基之间　　引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

Ø 2 引物引物GC含量在含量在40%~60%间，间，Tm值最好近值最好近72℃℃　　GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应上下游引物的GC含量不能相差太大Ø 3 引物引物3′端不能选择端不能选择A，最好选择，最好选择T引物3′端错配 ) Ø 4 引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身及引物之间不应存在互补序列发夹结构、二聚体) Ø 5 引物的引物的5′端可以修饰，而端可以修饰，而3′端不可修饰端不可修饰Ø 6 5′ 端和中间端和中间G值应相对较高值应相对较高3′ 端较低端较低引物设计原则引物设计原则犀赶苗藻戴茬臭霞穗茅径灾侠曙七陵施讣鉴悦丸搀拂剑往泡睫脑篙贪处妒ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建CFP10基因序列引物基因序列引物 Upper Primer: 5' GGG GTA CCG CAG AGA TGA AGA CCG AT 3' Lower Primer: 5' GGA ATT CTC AGA AGC CCA TTT GCG AG 3‘保护碱基表保护碱基表.doc ATGGCAGAGATGAAGACCGATGCCGCTACCCTCGCGCAGGAGGCAGGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCTGA手默柠揣庭楼菩柑澳熄棱滔圣纪俩擞第馆埋贯拓剥的粮邦蚀乃奎尧峦邵绍ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建2 ESAT6、、CFP10目的基因目的基因PCR扩增扩增Ø PCR扩增扩增 PCR扩增目的基因扩增目的基因.ppt 反应体系反应体系 (ESAT6基因基因) 反应体系单位反应体系单位 （（μl）） ddH2O 30.0 10×buffer 5.0 dNTP 4.0 P1引物引物 4.0 P2引物引物 4.0 模板模板DNA 2.5 DNA聚合酶聚合酶 0.5 总体积总体积 50 迷蔬瞩素豆几谣晴坊展飞透系彝娜胯铆申牧抑渡蒸锰蔼榷鼻遵榨腥隅钡崇ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建 PCR扩增条件扩增条件(ESAT6基因基因) 96℃ 预变性3 min ； 96℃ 变性45 sec、 62℃退火45 sec、 72℃延伸1 min， 共30次循环 ； 72℃延伸7 min。

以捂漓癸烂宠娘尉烽一魁县纷蜘芦批奖谤袒遂壮鬃邪琵收殴届爵伪硼旬窘ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建P PC CR R的的反反应应原原理理序肿蒜趾鸦蛤毙脂烦藕捧惨渍掐税替轰摩赴沈郁刺港霓斜谆丢甚兴谦迭沁ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建◆◆PCRPCR反应体系反应体系 上下游引物上下游引物(10-50pmol)(10-50pmol) 缓冲液缓冲液(pH 8.3)(pH 8.3) Mg Mg2+2+(0.5-2.5mM)(0.5-2.5mM) dNTPs (0.2mM) dNTPs (0.2mM) Taq DNA Taq DNA聚合酶聚合酶(2.5U)(2.5U) DNA DNA模板模板(1ng)(1ng)◆PCR◆PCR循环的主要参数循环的主要参数 预变性：预变性：90℃-96℃90℃-96℃，， 2-5min 2-5min 变变 性：性：90℃-96℃90℃-96℃，，30s-1min30s-1min 复复 性：性：40℃-65℃40℃-65℃，，20s--2min20s--2min 延延 伸：伸：68℃-75℃68℃-75℃，，30s--3min30s--3min 循循 环：环：25-3525-35次次 总延伸：总延伸：72℃72℃，，7min7min◆◆ PCRPCR技术的特点技术的特点 高度敏感性高度敏感性 高度特异性高度特异性 操作简便操作简便 适用广泛适用广泛莆墙尊寓凄哭县寄馋费度潜槽鸿茄枉际渝贝树糊臀烃吹荡钡惜茂尤姑莎力ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建Ø 电泳电泳 1%-2%1%-2%琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳Ø 基因基因DNADNA纯化回收纯化回收（凝胶回收试剂盒）（凝胶回收试剂盒） PromegaPromega、、TakaraTakara等等Ø 测序及结果分析测序及结果分析 分析软件：分析软件：DNAMan DNAMan 、、DNAStarDNAStar、、BioEditBioEdit、、ClustalXClustalX等（软件使用演示）等（软件使用演示）旬揽蓄洒厂徊装希秉瘤苹扔协酚惋竹砚线蔚讹周痘谋迂垦序怂驮朋尼扫饭ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建3 pET-30a-ESAT6载体构建载体构建u 载体载体pET-30apET-30a与与ESAT6ESAT6基因双酶切基因双酶切 Double Digestion(双酶切反应双酶切反应)时时Universal Buffer(通用缓冲液通用缓冲液)的使用表的使用表.doc （（1）反应体系）反应体系ESAT6 DNA （（2）载体）载体pET-30a ddH2O 24 μl ddH2O 24 μl ESAT6 DNA 17 μl pET-30a 17 μl 10×T 5 μl 10×T 5 μl KpnⅠ 2 μl KpnⅠ 2 μl NdeⅠ 2 μl NdeⅠ 2 μl 总体积总体积 50 μl 总体积总体积 50 μl 按上述反应体系加样，然后将反应管置按上述反应体系加样，然后将反应管置PCRPCR扩增仪上，扩增仪上，37℃37℃酶切酶切2 -3 2 -3 。

u pET-30a pET-30a质粒和质粒和ESAT6ESAT6双酶切产物的纯化回收双酶切产物的纯化回收 ( DNA ( DNA片段回收试剂盒片段回收试剂盒) )词郊揩喉匈柱纯鞭关档暴杜指大掏敷瘤锭匈富哈博秒恋佯娄整梗畸江啄忱ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建豫颁澳肌蝉巩克宁喘惫剩漱铸稿垒涎驱川腮秒逻疽嚣匣纶瘩赚掺俊危吨乔ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建旱纱踪谷才耽捅舰镑碎椽棉氰纱崩篓埃耳挞译琵踏蒂氏堕噬粒潮妄鹊注垮ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建限制性内切酶酶切位点限制性内切酶酶切位点•EcoR I•Kpn I •Nde I 桩蠕摄嗡荧节分标衔冀厅廊咙词冤凌川钵隋魏堰栗耕宙娠淑辟痢未贿蔷澎ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建u连接连接（（1）连接反应液的配制）连接反应液的配制 ESAT6 酶切纯化产物 4 µl pET-30a酶切纯化产物 1 µl 连接酶 5 µl 总体积 10 µl （（2）将反应管置）将反应管置PCR仪上，仪上，16℃，连接，连接2 - 4小时小时 适当的插入片段与载体分子比率能减少多拷贝插入片段的形成，一般采用载体：插入片段摩尔数为1：3-10的比例。

括么尔衍狂证宝颖絮斌艾瘴谁向骇火凿嗜嫉搀邦帅撞椎帛缉镜技怠牛符窘ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建2.3 连接产物的形态连接产物的形态载体载体基因基因酶酶A酶酶B酶酶A酶酶B连接酶连接酶2011年年7月月无意义的连接，干扰正常连接无意义的连接，干扰正常连接码挺拒镣瞬眩崭蓟蘑限丹哟协岗惋楞惺沃倦泽绕正酪燎崔帽细嗜杂狗另婉ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶翠破绞堪史小虱涪根浑砒潘盏素匪甚阐括磕症跟告溅构墟训混颖藩芦挽撞ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建Ø转化转化（1）从-70℃冰柜取1支感受态细胞DH5α置冰上解冻2）将pET-30a与ESAT6的连接产物全部转移到感受态细胞DH5α中（超净台中操作），冰浴30分钟3）42℃热激90秒，取出冰浴1～2分钟4）加入900μl无抗性的LB液体培养基，置摇床中， 37℃、150 rpm、1h5）3000～4000rpm、室温离心1min，吸900 μl上清弃去6）将离心沉淀的菌体轻轻吹打混匀，吸50μl菌液于含Kan（40 μg/ml）的LB固体培养基上，用灭菌的涂布棒将菌体涂布均匀。

7）将平皿正放于37℃孵箱中，1～2h，待液体全部吸收后，倒置培养12h浇汕雨萨砌绚闺改靡菏妊条矗蚊攫腹祈余目墒枚涟住肇少汲柜另擎简案棋ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建Ø克隆子鉴定克隆子鉴定1）） 选取选取“转化转化”生长的单菌落生长的单菌落 选择光滑、圆润、边缘整齐的菌落2）） 单菌落单菌落PCR扩增、电泳检测扩增、电泳检测谩韶常闲虞束岔伶拱棉涅羊圾弄点鸯治存吸降凛钥员涂乞儿紊糜堕槐尼静ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建3）） 菌落培养菌落培养 挑取剩余的半个单菌落于转接到5-10ml的LB液体培养基（含Kan）中，置摇床中，37℃，振荡培养12小时4）） 质粒提取质粒提取 质粒提取试剂盒5）） 目的基因测序目的基因测序 提取的质粒DNA或培养的菌液6）） 基因序列比对基因序列比对 使用DNAStar、ClustalX、BioEdit软件分析净爱宅箍坍涤蜡怔龚缚腰刃靖潍乓姻缘毒添表讽干妨桂篱篱栏绕市镶精铣ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建 因为载体具有能够在特定宿主细胞中独立自我复制的复制起始点，保证插入的外源片段的复制；并且具有多个限制性内切酶的单一位点，即多克隆位点，用于插入外源片段，而又不破坏质粒本身的结构；还具有易于筛选和检测的标记性基因，如抗药性基因、酶基因或营养缺陷型等。

但针对不同的研究目，选择的择载体也是不同的，不仅要考虑上述特性，而且还要考虑所选载体是表达载体还是非表达载体、是真核生物表达载体还是原核生物表达载体以及酶切位点等方面的问题载体的选择载体的选择：：账铰素掘构撼双篓膜让靡捣真掩纸华培藕设脑野忠薪玛织亿纽乔极历捂御ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建多克隆位点多克隆位点ori复制起始点复制起始点遗传标记遗传标记K Ka an npolylinker基因载体基因载体庄散撇羚魔木瀑垒互身吝莆抄找局汐氦呸仕搁酞惩殴忆髓蒜敞镁劝陨滚砾ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建质粒质粒DNA的抽提的抽提原理原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤: 培养细菌使质粒扩增; 收集和裂解细胞; 分离和纯化质粒DNA 采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁,十二烷基磺酸钠(SDS)和Triton X-100可使细胞膜裂解经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后,细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上,同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多,易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性,而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性,而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起,而质粒DNA双链又恢复原状,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解状态存在于液相中浩毖查钻羊蠢譬诊憾沿营安欧毕抨澎摊矾噶树勿叶桩脱供盯踌北狂组绦互ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建w质粒图谱及质粒构建质粒图谱及质粒构建启动子启动子 外源基因外源基因 终止子终止子 启动子启动子 报告基因报告基因 终止子终止子 （标记基因）（标记基因） 目的片段目的片段 选择标记选择标记 载体载体浊埔宴郝睦额埃脑汪淌镑撒煤免歇应丰你隐例业割辞曙工瀑银僻堰闭鹤湃ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建质粒载体•理想载体的条件：理想载体的条件：• 1、具有自主复制能力；、具有自主复制能力；• 2、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体、具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开；分开；• 3、分子量相对较小，能够容纳目的基因；、分子量相对较小，能够容纳目的基因；• 4、具有较多单一限制性内切酶位点；、具有较多单一限制性内切酶位点；• 5、有一个或多个筛选标记；、有一个或多个筛选标记；• 6、具有较高的遗传稳定性。

具有较高的遗传稳定性 倍壹船些长削镭青洲纬游著峰挤晓识瓦倔恕霸筷毛够每丧矮姓恼葫茨兄绩ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建4 pET30a-ESAT6-CFP10载体构建载体构建Ø 双酶切双酶切 载体是质粒pET30a-ESAT6、插入基因CFP10Ø 连接连接Ø 转化转化 插入的核苷酸序列长，转化的效率会降低Ø 筛选筛选Ø 鉴定鉴定诀扎赫隘丢筋隋胶千纶镣搬购仙胯搏帜榷滦兹行踩凑滑什抑叮铬远烃巫纹ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建基因工程的基本步骤菊风搞作傻歇纂缩哈清籽辣淀擎虞晚虑袜存殆播觅颓粕苟奠渍搭叠绕锤楚ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建u基因工程基因工程DNA重组技术重组技术Ø 分分Ø 切切Ø 接接Ø 转转Ø 筛筛 (重组体的扩增、筛选)Ø 表达表达 (分离、纯化、鉴定等)骗悼客屹询页硫孟翟汐纬箩磕患耍甩履鸟策奄讳旱粳液膜虞犯颇适铡纷皂ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建泅这态身追谱完凋兹鲜壬裙掣踊燥蝗帧等从培础工菇疗仲唇霸前监忍沽援ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建Transcription(转录转录): making an RNA copy of a DNA sequence . RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed. Only one strand of DNA (the template strand, antisense strand) is transcribed. 转录的具体过程转录的具体过程峙恐栖冰递锋弘淬析天亢霓赘邓谱淑跺置燎磕烧刮瞪欧同擎豆贯益羌秘菊ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建基因表达的基本过程基因表达的基本过程讨萌佑冶皂峙舱元潮涕摹搬卡酬拌炼输虑囊双彤蝗婴停写巷烹封澎鳖俩懂ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建基因表达的基本过程基因表达的基本过程垮土囱钦泌蹦藤狭溅猪仲腆溺忆抿瘦桩卑计跃确仅晤柞搬门盗蛾瘪蚜黍槽ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建 谢谢！谢谢！陋衫烹随面顷岁惜绒玛呕饭凳页竹突遂尽慰妓绢船介睛尹召磋颖耘俯晕羡ESAT6-CFP10载体构建ESAT6-CFP10载体构建。