原生质体培养和体细胞杂交.ppt

植物组织培养Good Morning第7章 原生质体培养与体细胞杂交原生质体的分离与纯化原生质体培养原生质体融合第7章 原生质体培养与和体细胞杂交本章主要内容(3学时)(1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤；(3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方凑 第7章 原生质体培养与和体细胞杂交本章教学目的与要求原生质体（Protoplast）l含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具 有生活力的裸露细胞第7章 原生质体培养与和体细胞杂交微 丝叶绿体线粒体质 膜细胞核内质网微 管细胞壁高尔基体植物细胞模式图植物细胞模式图第7章 原生质体培养与和体细胞杂交液 泡第一节、原生质体分离及纯化l一、原生质体分离双子叶外植体胚性细胞第7章 原生质体培养与和体细胞杂交l多数植物分离原生质体的经典材料----- 叶肉细胞第一节、原生质体分离及纯化（一）材料来源l禾本科植物：愈伤组织或悬浮细胞第一节、原生质体分离及纯化（二） 分离方法机械分离法酶法分离法1、机械分离法（Machanical isolation）第一节、原生质体分离及纯化优点： （1）能排除酶的有害影响； 缺点： （1）原生质体的产量低； （2）方法繁琐费力； （3）局限性大（1）酶的种类l纤维素酶类（Cellulase） l果胶酶类（Pectolyase） l半纤维素酶类（Hemicellulase） l崩溃酶 l蜗牛酶2、酶法分离（Enzymatic isolation）第一节、原生质体分离及纯化（2）酶液的配制第一节、原生质体分离及纯化渗透压稳定剂 及pH酶的配比及浓 度（3）分离原生质体第一节、原生质体分离及纯化两步分离法一步分离法方法有二：叶肉原生质体分离提纯图示原生质体分离过程（以叶片为例）第一节、原生质体分离及纯化过滤、离心加果胶酶 和纤维素酶第一节、原生质体分离及纯化叶片愈伤组织二、 原生质体纯化与活力测定（一）原生质体纯化第一节、原生质体分离及纯化方法三种离心沉淀法漂浮法界面法1、 离心沉淀法l原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原 生质体沉于底部。

l步骤：l第一步原生质体溶液用400目网筛过滤l第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）l第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉 淀如此2-3次l第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体 第一节、原生质体分离及纯化2、漂浮法Ø原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体 漂浮在液体的表面l步骤：l第一步：400目网筛过滤l第二步：离心l第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀 2-3次l第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1 次第一节、原生质体分离及纯化3 、 界面法25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其 中一种溶液密度大于原生质体的密度， 另一种溶液小于原生质体的密度第一节、原生质体分离及纯化（二） 原生质体活力测定1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的 细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体 2、染色识别l1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被 染色，死亡的被染上色l2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微 镜下有荧光的即为有活性的原生质体第一节、原生质体分离及纯化第二节 原生质体培养一、培养基pH渗透压钙镁生长物质氮源碳源培养基第7章 原生质体培养与和体细胞杂交二、培养方法培养方法液体浅层培养平板培养法双层培养法饲养层培养法第二节、原生质体培养1、液体浅层培养第二节、原生质体培养原生质体 悬浮液1mm厚液体培养基2x105/ml2、平板培养原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4% 琼脂或琼脂糖（37C左右）等体积混合成0.7% ，培养于培养皿中。

第二节、原生质体培养3、双层培养法（固、液培养）培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固 体培养基，在其上进行原生质体浅层培 养第二节、原生质体培养固体培养基4、饲养层培养方法一：X-射线杀死原生质体，与生活 力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂 ，制成混合液，培养于培养皿中第二节、原生质体培养方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼 脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养 层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼 脂混合，培养于饲养层上4、饲养层培养第二节、原生质体培养第一次分裂第二次分裂第三次分裂多细胞团第二节、原生质体培养原生质体的分裂肉眼可见细胞团愈伤组织器官发生途径 胚胎发生途径植株第二节、原生质体培养植株再生途径定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交， 使分离出来的不同亲本的原生质体，在人 工控制条件下，相互融合成一体，形成杂 种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术 第7章 原生质体培养与和体细胞杂交第三节、原生质体融合一、原生质体融合意义—克服杂交不亲合—克服生殖器官败育—克服柑桔多胚第三节、原生质体融合番茄+马铃薯第三节、原生质体融合二、融合方法无机盐诱导融合高pH-高Ca离子聚乙二醇(PEG)法PEG结合高钙-高pH诱导法电融合技术第三节、原生质体融合(一)无机盐诱导融合: NaNO3法l1972年： Carlson诱导原生质体融合获得 首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞 杂种。

NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高第三节、原生质体融合1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶 液在37℃时，诱发烟草叶肉原 生质体融合优点：杂种产量高 不足：高pH值对细胞有毒害作用第三节、原生质体融合（二）高pH-高Ca离子法PEG法特点：融合频率高可重复性强诱发融合无特异性毒性较低植物+植物 植物+动物 动物+酵母Polyethylene Glycol（聚乙二醇）第三节、原生质体融合（三）PEG法PEG法原理PEG是一种带负电性的高分子化合物，在 原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原 生质体凝聚在洗脱过程中，PEG将被洗掉， 导致质膜表面电荷重排粘连的质膜大面积紧 密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负 性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相 连而导致融合第三节、原生质体融合PEG法示意图第三节、原生质体融合-+-桥梁+-PEG被洗掉+-+-电荷重排+-+-+-+-膜接触最为常用 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质 体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加 高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生 质体培养液洗涤数次---离心获得原生质 体细胞团---筛选---再生杂合细胞第三节、原生质体融合（四）PEG结合高钙-高pH诱导法(五)电融合技术Senda 1979年首先用此方法实现原生 质体融合细胞融合仪第三节、原生质体融合电融合法原理交流电场使原生质体表面电荷偶极 化，沿着电极排列，形成串珠。

负极正极+-+-+ -+-第三节、原生质体融合+-+-+-+-施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质 膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流第三节、原生质体融合+-+ -+-+ -+-+ -+-+-原生质体的融合过程：第三节、原生质体融合三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定1．互补选择法第三节、原生质体融合2、机械分离杂种细胞法3. 双荧光标记选择法异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色3. 双荧光标记选择法第三节、原生质体融合第三节、原生质体融合4-1、形态学鉴定第三节、原生质体融合4-2、细胞学观察染色体形态和数目的比较18条染色体36条染色体第三节、原生质体融合4-3、 DNA内切图谱分析RAPD带型（随机扩增的多态性DNA）第三节、原生质体融合(1) 原生质体培养的意义：(1)再生植株； (2)用于远缘 体细胞融合，进行体细胞杂交 (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离 (3)酶的种类及特点 (4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面 法 (5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别第7章 原生质体培养与和体细胞杂交本章小结：（6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养； 悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 （7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇 与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。

（8）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种 细胞法；双荧光标记选择法 （9）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察； DNA内切图谱分析；同工酶分析第7章 原生质体培养与和体细胞杂交本章小结：兰花第7章 原生质体培养与和体细胞杂交。