中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》（20重点.doc

lt;p><p><p><p>《 中 药 制 剂 分 析 》课 程 论 文中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则及 其在《中国药典》 (2015年版 中的应用 药学(药物分析方向 2012级指导教师:高晓霞2015 年 11月摘要:中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题,鉴于传统基原鉴定、性 状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性,为保证中药材临床应用安全、准确、有效, 有必要增加中药材 DNA 条形码分子鉴定法 如今分子生物学技术在中药材鉴定领域的应用已 逐步深入 《中国药典》 2010年版收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的 DNA 分子鉴 定方法,而《中国药典》 2015年版收载了“中药材 DNA 条形码分子鉴定法指导原则” , DNA 条形码分子鉴定法是利用公认的相对较短的 DNA 序列来进行物种假定的一种分子生物学技 术, 是传统形态鉴别方法的有效补充 这标志着中药材的分子鉴定由实验室科研层面进入国 家标准的应用层面关键词:中药材; DNA ;鉴定;指导原则一、 中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则 [1]1.1定义及原理该鉴定方法主要适用于中药材 (包括药材、 药材粉末及部分药材饮片 及基原物种的鉴 定。

DNA 条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的 DNA 序列来进行物种鉴 定的一种分子生物学技术, 是传统形态鉴别方法的有效补充 由于 DNA 序列是由腺嘌呤 (A 、 鸟嘌呤(G 、胞嘧啶(C 、胸腺嘧啶(T 4种碱基以不同顺序排列组成,因此一定长度 DNA 序列能够区分不同物种中药材 DNA 条形码分子鉴定指导原则通过对大样本量中药材进行 DNA 条形码分子鉴定研 究, 建立以 ITS2为核心, psbA-trnH 为辅的植物类药材 DNA 条形码鉴定体系和以 COI 为主、 ITS2为辅的动物类药材 DNA 条形码鉴定体系1.2方法与步骤中药材 DNA 条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、 DNA 提取、 PCR 扩增、测序、序列 拼接及结果判定,以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项1.2.1 供试品处理 除特殊标明外, 药材使用 75%乙醇擦洗表面后晾干, 称取 10~100 Mg 2+备用1.2.2 DNA提取 DNA的提取包括破碎细胞壁、释放 DNA , DNA 的分离和纯化, DNA 的浓 缩、 沉淀与洗涤等基本步骤, 目前常用试剂盒法, 包括植物基因组 DNA 提取试剂盒和动物组 织 /细胞基因组 DNA 提取试剂盒。

由于植物类中药材种类繁多, 可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以改进 植 物细胞内含有大量次生代谢产物,如多糖、多酚等,这些物质在提取 DNA 的过程中与 DNA 共沉淀, 形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变, 严重影响 DNA 提取的产量与质量, 以及后续的 PCR 扩增实验 EDTA (乙二胺四乙酸螯合 Mg 2+2+或 Mn 2+,抑制 DNase (DNA 酶活性; CTAB (十六烷基三甲基溴化铵 是一种阳离子表面活性剂,可溶解细胞膜, 与 DNA 形成复合 物溶于高盐溶液, 降低溶液盐浓度至一定程度, 则从溶液中沉淀, 经离心即可将 CTAB 与 DNA 复合物同蛋白质、多糖类物质分开三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl (pH 8.0提供一个 缓冲环境,防止 DNA 被破坏 β-巯基乙醇是抗氧化剂,在提取 DNA 过程中加入 β-巯基乙 醇,可以抑制氧化反应,避免褐化 PVP (聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物,能与多酚形成 一种不溶的络合物质, 有效去除多酚, 减少 DNA 提取过程中多酚的污染; 同时它也能和多糖 结合,有效去除多糖因此将 PVP 和 β-巯基乙醇配合使用,能够有效地防止 DNA 提取过程 中多酚及多糖的污染。

在提取根、根茎、茎木类、皮类的 DNA 时,一定要注意多糖、多酚的去除;提取叶、花、全 草的 DNA 时要适当增加水浴时间, 并可将水浴温度降低; 对于果实、 种子类以及动物药材类 的 DNA 提取可以参考《中国药典》 1.2.3 PCR 扩增 植物类中药材及其基原物种扩增 ITS2或 psbA-trnH 序列,动物类中药 材及其基原物种扩增 COI 序列,通用引物及扩增条件如下,具体如有改变见各药材项下 ITS2序列扩增正向引物 ITS2F :5′ -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′;反向引物 ITS3R : 5′ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′ psbA-trnH 序列扩增正向引物 psbAF :5′ -GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′; 反向引物 trnHR :5′ -CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′ COI 序列扩增正向引物 HCO2198:5′ -TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′; 反向引物 LCO1490: 5′ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′PCR 反应体系以 25 μL 为参照, 包括 1× PCR 缓冲液 (不含 Mg 2+Cl 2 , 2.0 mmol·L-1Mg 2+Cl 2, 0.2 mmol·L-1 dNTPs,0.1 mmol·L-1引物对,模板 DNA , 1.0 U Taq DNA聚合酶,加灭菌双 蒸水至 25 μL 。

设置未加模板 DNA 的 PCR 反应为阴性对照ITS2序列扩增程序:94 ℃ 5 min ; 94 ℃ 30 s , 56 ℃ 30 s , 72 ℃ 45 s , 40个循环; 72 ℃ 10 min psbA-trnH 序列扩增程序:94 ℃ 5 min ; 94 ℃ 1 min , 55 ℃ 1 min , 72 ℃ 1.5 min , 30个循环; 72 ℃ 7 min COI 序列扩增程序:94 ℃ 1 min ; 94 ℃ 1 min , 45 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 1.5 min, 5个循环; 94 ℃ 1 min, 50 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 1 min, 35个 循环; 72 ℃ 5 min1.2.4 PCR 产物检测 采取琼脂糖凝胶电泳方法检测 PCR 产物电泳后, PCR 产物应在相 应的 DNA 条形码序列长度位置出现一条目的条带,阴性对照应无条带1.2.5 测序 有 PCR 扩增条带的样品送测序公司进行 DNA 序列测定使用 DNA 测序仪对目的条带进行双向测序, PCR 扩增引物作为测序引物,测序原理同 Sanger 测序法1.2.6 中药材 DNA 条形码序列获得 主要包括序列拼接和序列质量与方向 2个方面的内 容。

对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接, 去除引物区,获得相应的 DNA 序列为确 保 DNA 条形码序列的可靠性, 需对测序质量进行评估, 去除测序结果两端的低质量序列 序 列方向应与 PCR 扩增正向引物方向一致1.2.7 结果判定 将获得的序列在中药材 DNA 条形码鉴定系统(http :// 或 GenBank 数据库中应用 BLAST (basic local alignment search tool 方法进行结果判定, 结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种 如果植物 类药材 ITS2序列比对后最接近的物种为真菌, 则需采用 psbA-trnH 序列重复上述方法流程 中药材 DNA 条形码鉴定数据库系统及 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统操作流程见下登录中药材 DNA 条形码鉴定数据库系统网站, 在主页点击“物种鉴定” 根据需鉴定物 种的种类,选择对应的鉴定数据库,如点击植物类药材鉴定(ITS/ITS2 将需要鉴定的物 种序列复制后粘贴到“植物类药材鉴定(ITS/ITS2”的序列输入栏,点击“提交”按钮, 进行 BLAST 鉴定 在 BLAST 比对结果中, 在“序列比对信息”栏查看相关比对信息, 在“物 种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。

登录 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统 (http ://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi , 在 Basic BLAST中选择 nucleotide blast,在 Enter Query Sequence中粘贴需要鉴定的序 列(Query (建议用 fasta 格式 在 Choose Search Set 中选 others (nr etc. 数据库, 点击左下角 BLAST 在 BLAST 结果中查看序列相似性最高(max ident的物种,一般为与 查询序列最接近的物种1.3 方法学验证1.3.1方法适用性考察 采用 DNA 条形码分子鉴定法对 20批次以上药材或基原物种进行 测定,积累数据,确定种内序列变异大小,保证该测定方法的适用性1.3.2 精密度考察 主要分为重复性考察、中间精密度考察及重现性考察重复性, 至少用 3批供试品, 每批 3次或同批供试品进行 6次测定试验后对结果 进行评价实验结果判定应基本一致中间精密度, 考察实验室内部条件改变 (如不同人员、 不同仪器、 不同工作日和 实验时间对测定结果的影响,至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。

重现性,实验结果在 3家以上实验室能够重现,相同样品在不同实验室获得 DNA 条形码序列应相同1.3.3影响因素考察 考察 DNA 条形码分子鉴定法的影响因素, 包括 DNA 提取 (样品量、 水浴温度和水浴时间 、 PCR 条件 (变性时间、 退火温度与时间及延伸时间 及产物纯化 (考 察不同纯化试剂盒 ,保证实验方法的准确性1.3.4 基原物种对比验证 以分类学家确认的基原物种叶片为对象,采用该方法获得 DNA 条形码数据,与相应药材产生的 DNA 条形码数据进行对比,避免内生真菌等污染,保证 结果准确性1.4 中药材 DNA 条形码分子鉴定核心序列选择依据1.4.1植物类中药材 ITS2和 psbA-trnH 条形码的选择依据 DNA条形码研究的首要任务 是确定通用 DNA 条形码序列 在植物界, 研究者主要从叶绿体基因组和核基因组中寻找理想 的 DNA 条形码,曾提出诸多候选条形码序列或组合 2009年,国际条形码协会植物工作组 对来自 550个物种 907个样品的 7个序列 (rbcL , matK , rpoC1, ropB , psbA-trnH , psbK-psbI , atpF-atpH 进行了分析比较,建议将 rbcL+matK组合作为植物通用条形码 [10]。

然而,植 物工作组认为该组合还远不够完美,寻找植物 DNA 条形码的工作还没有结束 [2]同年,在墨 西哥召开的第三届国际条形码大会上,与会代表一致认为应对 ITS/ITS2和 psbA-trnH 序列 进行进一步评估2010年, 陈士林等 [3]分析比较了 7个候选 DNA 条形码 (psbA-trnH , matK, rbcL, rpoC1, ycf5, ITS2, ITS 研究对象为药用植物及其密切相关物种研究结果表明 ITS2表现突 出, 在物种水平的鉴定效率高达 92.7% 因此, 陈士林等建议将 ITS2作为药用植物标准 DNA 条形码鉴于研究中 psbA-trnH 仅次于 ITS2序列,也具有较好鉴定能力,因而推荐其作为 ITS2的辅助条形码 Yao 等 [4]基于大样本量分析证实 ITS2序列可以作为植物物种鉴别的通 用条形码, 并以 ITS2序列为基础初步建立了药用植物 DNA 条形码数据库网络查询系统 (http : //its2-plantidit.dnsalias.org/ amp;amp;amp;lt;/p&amp;amp;gt;&amp;lt;/p&amp;gt;&lt;/p&gt;</p>。