高效液相色谱检测微生物细胞醌类组分的技术规程.doc

高效液相色谱(HPLC)检测微生物细胞 醌类组分的技术规程起草单位：中国典型培养物保藏中心目 次前 言............................................................................................................................................3 1.范围....................................................................................................................................4 2.术语与定义................................................................................................................................4 2.1.菌体真空冷冻干燥（freeze-drying）......................................................................4 2.2.高效液相色谱（HPLC） .........................................................................................4 2.3.旋转蒸发....................................................................................................................4 2.4保留时间 Ret.Time(RT)................................................................................................4 3.方法和条件................................................................................................................................4 3.1.试剂............................................................................................................................4 3.2.主要仪器与器材........................................................................................................4 4.醌样品的制备............................................................................................................................4 4.1 收集菌体.............................................................................................................................4 4.2 破壁.....................................................................................................................................4 4.3旋转蒸发........................................................................................................................4 4.4纯化................................................................................................................................5 5.高效液相色谱(HPLC)测定醌类组分.......................................................................................5 5.1.准备工作....................................................................................................................5 5.2 色谱条件.............................................................................................................................5 5.3结果分析........................................................................................................................5 参考文献............................................................................................................................................6前 言醌是微生物化学分类指征之一，它是原核生物原生质膜上的组份，在电子传递和氧化 磷酸化中起重要作用。

醌主要有两种类型:甲基萘醌和泛醌在革兰氏阳性细菌和放线菌中 主要合成甲基萘醌醌类组分中异戊二烯侧链的长度和氢的饱和度有重要的分类学意义 每种细菌都有一个主要的醌类组分，一个微生物群体中醌类种类和数量的不同反映了 群体组成的多样性，醌类谱已经作为细菌群体组成多样性的一个指标，在环境微生物中广 泛使用高效液相色谱测定醌类更快速，灵敏度高，操作简单，是一种醌类组分测定的理 想方法 制定本规程的目的在于提供了一种原核生物中醌类提取与 HPLC 检测的有效技术本规 程由武汉大学中国典型培养物保藏中心起草承担高效液相色谱(HPLC)检测微生物细胞醌类组分的技术规程1.范围本规程规定了高效液相色谱(HPLC)检测微生物细胞醌类组分的技术规程，本规程主要适 用于细菌等原核生物醌类组分的检测2.术语与定义 下列术语和定义适用于本规程 2.1. 菌体真空冷冻干燥（freeze-drying） 指将欲干燥的菌种细胞或孢子，经预冻后在真空条件下使水分升华 2.2. 高效液相色谱（HPLC） 高效液相色谱用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓 冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内， 在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。

2.3. 旋转蒸发 在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂，尤其对萃取液的浓缩和色谱分离时的 接收，可以分离和纯化反应产物 2.4保留时间 Ret.Time(RT) 是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间，等于组分在流动相中 停留的时间加在固定相中所停留的时间3.方法和条件 3.1. 试剂 醌提取试剂：：氯仿；甲醇；丙酮；苯；GF254 硅胶板(青岛海洋化工厂分厂，100×200 mm)；试剂均为分析纯 HPLC 检测试剂：甲醇（色谱纯） ；异丙醇（色谱纯） ；超纯水 3.2. 主要仪器与器材 高效液相色谱仪；旋转蒸发仪4.醌样品的制备 4.1 收集菌体 菌体摇瓶培养，通过离心收集菌体，蒸馏水洗涤两次，离心后真空冷冻干燥，如果暂 时不进行制备，菌粉可以于 4 ºC 保存备用 4.2 破壁 取冻干菌体约 100 mg，加入氯仿 : 甲醇(2 : 1；v/v)的溶液 40 mL，在黑暗处磁力搅拌 10 h 左右4.3 旋转蒸发在黑暗处用滤纸过滤收集滤液，用减压旋转薄膜蒸发仪 40℃减压蒸馏至干燥用少量 (1 mL) 丙酮重新溶解干燥物，长条状点样于 GF254 硅胶板上(青岛海洋化工厂分厂，100×200 mm)，硅胶板最好在 65℃活化半个小时左右。

同时在一端点 VK做对照4.4 纯化⑴ 以苯作展层剂，展层约 20 min取出风干后在 254 nm 紫外灯下观察Rf=0.8，在绿色 萤光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置，与 VK位点齐平，若 Rf=0.4-0.5 的位置有暗 褐色的带则为泛醌组分注意不能在紫外灯下长时间照射，以免醌降解) ⑵ 刮下显色的条带，用 1mL 丙酮溶解，然后用细菌滤器过滤除去硅胶，收集滤液(可适当 浓缩至 200 µL～300 µL),即得醌类组分的丙酮溶液置于 4℃, 黑暗处保存5.高效液相色谱(HPLC)测定醌类组分 5.1. 准备工作 5.1.1 溶剂的准备 正确准备溶剂对于高效液相色谱(HPLC)试验是非常重要的，它能有效地避免鬼峰、降 低基线噪声，从而提高分析能力HPLC试验均应使用高纯度的溶剂，HPLC级纯度的溶剂比 分析级(AR)溶剂的纯度更高，选择色谱级的甲醇与异丙醇作为流动相 要保证配制流动相用水的纯度足够高，用超纯水或从商店购买的纯净水 5.1.2 过滤 理想情况下，所有溶剂都要通过0．45 µm 滤膜过滤后再使用，这样能够有效防止由 于微粒存在导致流路管线堵塞、过滤后应把溶剂放在密封容器中，以防止被重新污染。

过 滤后的溶剂既可用于色谱分析，也可用于清洗诸如泵头、柱塞朴、单向和密封圈等仪器部 件，，最大程度地清洗好这些部件能保证系统性能良好 5.1.3 脱气 在流动相进入HPLC系统之前应首先脱气没有脱气的流动相进入到高压系统产生的气 泡会导致系统不稳、出现鬼峰等问题从溶液中排除气泡的方法主要有：氦气脱气、超声 波脱气和真空脱气氦气或其他低溶解度气体足脱气的有效方法；连续脱气可以防止 空气重新溶解在溶剂中 5.2 色谱条件 分析柱：C18 (ODS 5 µm ,250×4.6 mm id)； 流动相：甲醇 : 异丙醇 (2 : 1；v/v)； 流速：1.00 mL/min； 柱温：40 ºC； 检测波长：240 nm 和 270 nm 进样量：10µL5.3结果分析 在上述色谱条件下对已制备好的醌的丙酮溶液进行检测，将待测定的醌类样品与标准品图 谱对照，从而确定微生物中各个醌类组分以菌株 2622 的醌型图谱分析如下：0.05.010.015.020.025.030.035.040.045.0-50100200300450醌 2009-01-04 #11 [modified by Admin, 1 peak manually assigned]UV_VIS_2 mAUminMK-6MK-7Q-10WVL:270 nmNo. Ret.TimePeak NameHeightAreaRel.AreaAmountTypeminmAUmAU*min%111.51MK-6136.12030.27523.89n.a.BMB*^214.70MK-72。