【最新word论文】液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量【药学专业论文】.doc

1液相色谱法测定猪和牛脂肪中孕酮残留量作者; 姜维，方晓明，唐毅锋，庞国芳【摘要】 目的 建立脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留量的测定方法方法 色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm） ；流动相：乙腈-水（65:35） ；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl结果 样品的室内加标平均回收率为 86.7％～91.8％，室内相对标准偏差为 4.5％～6.0％，室间加标平均回收率为 81.4％～95.0％，室间相对标准偏差 3.7％～7.1％，定量测定低限（LOQ）为 10μg/kg结论 本方法简便，准确，可用于脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮残留含量的测定关键词】 高效液相色谱法;脂肪;醋酸美仑孕酮;醋酸甲地孕酮;醋酸氯地孕酮Determination of progestones in fat of beef and pork by HPLC【Abstract】 Objective To establish the determination method of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.Methods Chromatographic separation was carried out on a C18column（250mm×4.6mm，5μm）and acetonitrile-water (65:35) as the mobile phase.The flow rate was 1.0ml/min; the column temperature was 35℃; the detection wavelength was 292nm; the injection volume was 40μl.Results The intra-laboratory average recoveries ranged from 86.7％～91.8％ and RSD of 4.5％～6.0％.The inter-laboratory average recoveries added to standard ranged from 81.4％～95.0％ and RSD of 3.7％～7.1 ％.The lowest limit of quantitation (LOQ) is 10μg/kg.Conclusion The method is simple and sensitive.It is suitable for the determination of melengestrol acetate，chlormadinone acetate and megestrol acetate in fat of beef and pork.【Key words】 HPLC; fat; melengestrol acetate; chlormadinone acetate; megestrol acetate醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮为合成的孕激素类药物，有明显的孕激素和抗雄激素作用，可抑制排卵。

孕激素对垂体促性腺激素的释放有一定的抑制作用，动物实验表明有死胎率增加和致畸作用，副作用有：(1)恶心、头晕、倦怠；(2)突破性出血；(3)孕期服用，会增加女性后代的男性化作用孕激素类药物能增强体内物质沉积和改善生产性能，可以很快产生显著和直接的经济效益，因此，对生产者有很大的吸引力畜牧业中使用孕激素类药物(非治疗用途)已有很长的历史，但人类长期食用含有激素的肉制食品，即使含量甚微，亦会明显影响机体的激素平衡，而且有致癌危险，对幼儿造成发育异常等危害2因此，开发一种能检测孕酮残留量的方法是十分必要的检测孕激素类药物的方法有很多，如液相色谱/质谱法（LC/MS） ［1］ 、气相色谱/质谱法（GC/MS） ［2，3］和液相色谱法［4～6］等本文采用高效液相色谱法对牛和猪脂肪样品中的孕酮进行检测1 试剂与仪器1.1 试剂 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品（Sigama公司） ，乙腈（HPLC 级） ，甲醇（HPLC 级） ，乙酸乙酯（HPLC 级） ，其他试剂为分析纯水由 Milli-Q 净化系统（Millipore 公司）制得1）标准储备液：1000μg/ml，分别准确称取 0.050g 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准品于 50ml 容量瓶中，用甲醇定容。

于 4℃保存，可使用一年2）混合中间溶液 I：100μg/ml，分别吸取 10.0ml 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液于 100ml 容量瓶中，用甲醇定容于 4℃保存，可使用一年3）混合中间溶液 II：1.0μg/ml，取 1.00ml 混合中间溶液 I 于 100ml容量瓶中，用甲醇定容于 4℃保存，可使用半年4）混合标准工作液：分别吸取 10、20、40、80、100μl 混合中间溶液II 添加到 980、970、950、910、890μl 的乙腈-水（65:35）中，再加入 10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，得到浓度为0.010μg/ml、0.020μg/ml、0.040μg/ml、0.080μg/ml 和 0.10μg/ml 混合标准工作液，供液相色谱测定，当日使用1.2 仪器 Waters 液相色谱系统，510 泵体，486 紫外-可见光检测器，Emprower pro 色谱软件氮气吹干仪（Organomation Associates，Jnc.公司） ；固相萃取装置（Supelco 公司） ；低温离心机（德国 Eppendorf 公司） ；涡旋混匀器（XW-80A 型，上海医大仪器厂） ；CN 固相萃取柱（3ml，Waters 公司） 。

2 测定步骤2.1 试样的制备与保存2.1.1 试样的制备 把大约 5g 的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，放入 150ml 的烧杯中，将烧杯置于微波炉内根据所熬制脂肪量，使用最大功率，加热 30～60s，如果脂肪没有融化，可在间隔 30～60s以后重复加热 30～60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中把熬制好的脂肪油放入样品瓶中，密封，并做上标记32.1.2 样品的保存 把熬制好的脂肪油样品置于-18℃中，冷冻保存2.2 提取 称取熬制好的脂肪油 2.00±0.01g，置于 50ml 具塞离心管中，加入 5ml 乙腈，于 60℃水浴中保温 3min 以使固体脂肪溶化，涡旋振摇 1min，在-5℃下离心 7min（离心力 1160g） ，吸取上清液至 15ml 带塞聚丙烯离心管，再在沉淀物中加入 5ml 乙腈重复提取一次，合并上清液在合并的乙腈提取液中加入2×2ml 正己烷，涡旋振摇 1min，于-5℃中离心 5min（离心力 1160g） ，弃去正己烷层乙腈提取液于 60℃中用氮气吹干仪吹干，残渣待皂化2.3 皂化 在残渣（2.2 项）中依次加入 4ml 正己烷、1ml 0.1mol/L 氢氧化钠溶液和 0.5ml1.0mol/L 氯化镁溶液，于涡旋混匀器上快速混匀 10s，在 60℃水浴中保温 15min，于-5℃中离心 5min（离心力 1160g） ，吸取上清液至 15ml 玻璃试管。

在沉淀物中再加入 4ml 正己烷混匀后，在 60℃水浴中加热 15min 后，在-5℃中离心 5min（离心力 1160g） ，合并上清液于 60℃中用氮气吹干仪吹干，用 1.0ml 正己烷溶解残渣，待净化2.4 净化 将皂化后的样液（2.3 项）倒入经 5ml 乙酸乙酯和 6ml 正己烷预处理过的 CN 柱中，用 2×1ml 正己烷润洗玻璃试管，洗液倒入到 CN 柱中待样液流过后，依次用 5ml 正己烷和 6ml 5%乙酸乙酯的正己烷溶液淋洗柱子，随后打开真空泵将小柱中液体抽干，保持抽气 2min最后用 3.5ml 20%乙酸乙酯的正己烷溶液洗脱，洗脱液收集于 15ml 玻璃试管中，于 60℃中用氮气吹干仪吹干残余物用 990μl 乙腈-水（65:35）涡旋溶解，静止 15min 后，加入 10μl 0.2%盐酸溶液，混匀，供液相色谱测定2.5 测定2.5.1 液相色谱条件 色谱柱：Kromasil C18 柱（250mm×4.6mm，5μm） ；预柱：C18 柱（12.5mm×4.6mm，5μm） ；流动相：乙腈-水（65:35） ；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：292nm；进样量：40μl。

2.5.2 液相色谱测定 根据样液中 3 种孕酮的含量情况，选定浓度相近的标准工作液，标准工作液和样液中 3 种孕酮的响应值均应在仪器检测的线性范围内标准工作液和样液等体积参插进样测定在上述色谱条件下，标准品的色谱图见图 1图 1 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮的色谱图（100ng/ml）1-醋酸甲地孕酮，2-醋酸氯地孕酮，3-醋酸美仑孕酮 3 结果与讨论3.1 线性范围 醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮浓度在0.010～0.10μg/ml 范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数4（γ2）均大于 0.9983.2 回收率、精密度和定量检测限 本实验以 2 种脂肪（牛脂肪和猪脂肪）作为样本取适量标准品加入到 2.0g 样品中，使添加量相当于 10、20 和50μg/kg，每个添加水平各取 24 份试样（每种脂肪各 12 份） 图 2 为空白脂肪样品和添加样品（10μg/kg）的色谱图表 1 为醋酸美仑孕酮，醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮外标法测得的室内回收率和精确度表 2 为 8 家实验室的室间回收率和精确度结果根据回收率试验，能可靠测得的最低浓度确定定量检测限（LOQ） ，LOQ 为 10μg/kg，满足残留限量的检测要求。

A）（B）（C）（D）图 2 空白脂肪样品和添加样品（10g/kg）的色谱图 A：牛脂肪空白样；B：猪脂肪空白样；C:牛脂肪添加样；D:猪脂肪添加样表 1 室内回收率和精确度的结果 (每一添加量，n=24)表 2 8 家实验室室间回收率和精确度的结果 (每一添加量，n=32)【参考文献】1 Hooijerink H，van Bennekom EO，Nielen MWF.Screening for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.Anal Chim Acta，2003，483(1-2): 51-59.2 Neidert EE，Gedir RG，Milward LJ，et al.Determination and qualitative confirmation of melengestrol acetate residues in beef fat by electron-capture gas chromatography and gas-chromatographic chemical-ionization mass spectrometry.J Agric Food Chem，1990，38(4): 979-981.3 Impens S，Courtheyn D，de Wasch K，et al.Faster analysis of anabolic steroids in kidney fat by downscaling the sample size and using gas chromatography-ta。