蛋白质含量测定07934.doc

实验十六  蛋白质含量的测定  衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数即可计算该样品的蛋白质含量    一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55    一、目的与要求：    掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算    二、原理：    凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下    ( 1 )  2NH2(CH2)2COOH+13H2S04    (NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2    (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4     (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O(4)  (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2三、试剂与仪器：1、硫酸钾2、硫酸铜    3、硫酸4、2％硼酸溶液5、40％氢氧化钠溶液6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成．    7、0.01mol/LHCL标准溶液或0．01mol/L硫酸标准溶液．8、KDN-08A(04A)定氮仪10、三角瓶250ml 3只。

11、量筒50ml、l0ml、l00ml12、吸量管10ml只13、酸式滴定管1支14、容量瓶100毫升1只15、小漏斗1只四、实验步骤1.样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，将消化管分别放入消化架各个孔呢，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通上自来水龙头，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段防止样品飞溅（选用电压型控温的消化炉起先控制在150伏左右，15min左右后可满电压工作）待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验2.蒸馏：(KDN-08A为例)蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH ，H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定（一般碱液加量是消化时硫酸用量5倍以上，加蒸馏水量15ml左右）向接收瓶内加入50ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液于定氮瓶中，加入10ml 40%氢氧化钠溶液，开始蒸馏，在接收瓶内接收液达150ml左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗滴管口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用。

3.滴定：取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作    （V1-V2）*N*0.014X =------------------------------  +F*100             m*（10/100）                                                     计算：　 　X：样品中蛋白质的含量，g；V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；m：样品的质量（体积），g（ml）；F：氮换算为蛋白质的系数注：（1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。

使氮有损失5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液8）氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性9）吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++附：0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液及标定（自己查资料，写出操作步骤）附定氮仪说明书‘KDN-08A(04A)定氮仪说明书一． 工作原理定氮仪检测原理为（凯氏原理）：取样 消化 蒸馏 滴定 计算它由消化炉（可选本公司各个型号）与定氮仪蒸馏器组成。

消化炉使用井式加热炉进一步打到完美，使试样置入消化管插入井式加热炉内加热取得最佳的热效应，在消化前置入催化剂进一步加速消化煮解，大大缩短消化时间消化管内溢出的SO2等有害气体，通过消化管上的排污管经抽气三通由水带入下水道（也可用真空泵加回收瓶回收），有效的抑制有害气体的外逸，又省略了实验室中安装通风橱，试样经40分钟左右消化煮解，即可完全消化尽二． 技术参数1. 测定品种:粮食，饲料，食品，乳制品，饮料，土壤，水，药物，沉淀物和化学品等2. 测定样品量：固体＜5g/个，液体＜15ml/个3. 测定范围：0.1mgn-200mgn(含氮量0.02%-95%)4. 工作电压:220V 50HZ5. 电耗：蒸馏器800W，消化炉（四孔1200W）（八孔2400W）三． 操作方法1. 试剂准备a. 硫酸（比重1.84）b. NaOH溶液：400g NaOH溶于1000ml水中c. 2%H3BO3d. 0.1NHCLe. 催化剂：硒+无水硫酸钠（1:1000）或硫酸铜等f. 指示剂：0.1%甲基红+0.5%溴甲酚绿（1：1）2. 样品消化称取经粉碎通过40-60目/寸样0.5-1克（视含氮量而定）无损地置入已洗涤烘干的消化管中加催化剂5g左右和10ml左右硫酸。

将消化管分别放入消化架各个孔呢，然后置于消化炉上，然后开启抽气三通上自来水龙头，使抽气三通处于吸气状态，接通电源，在加热初始阶段防止样品飞溅（选用电压型控温的消化炉起先控制在150伏左右，15min左右后可满电压工作）.3. 蒸馏(KDN-08A为例)蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH ，H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自卑的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内，注入毫升数视标尺所注位置而定（一般碱液加量是消化时硫酸用量5倍以上，加蒸馏水量15ml左右）1. 打开电源，打开自来水龙头，接冷却水自来水龙头不必开过大，出水口有谁流出即可，用排水管子上夹子夹紧排水管子2. 开面板上右边蒸汽开关手柄往上推为开蒸汽，同时把左边进水开关手柄往上推为开，待电流表指针指在2A-3A时（如果水进入侧面蒸发炉慢，电流表长时间没反应，请用吸合球往正面的细长管内吹几下以排除馆内空气，看示意图指示）马上关把坐标进水开关手柄往下压，压到底压不下为关（尽量不要关太慢，防止电流过大二烧坏15A保险丝），待蒸汽管喷出气后又上推打开左进水开关供水，1分钟左右后电流稳定在3.5-6A左右后，关闭右蒸汽开关手柄往下压到底，压不下为关。

因为红色进水开关是控制机器内部产生蒸汽的水源开关，从测名的有机玻璃窗口内可以看到蒸发炉水位的高低，防止水位过高，因为一开始水没有沸腾，水不断进入，容易使电流过大而烧坏保险丝蒸汽开关是起通断蒸汽作用，也是水源进入蒸汽炉和排除蒸发炉水（实验结束时）的排水器件如果蒸汽出来后电流不大请开关一下，红色蒸汽开关会正常）上推为开，下压为关）2.在250ml三角接收瓶中加入50ml 2%H3BO3和2-3滴混合指示剂，并使接收瓶托架盘往上移，使滴管浸在液体中3．向上扳动侧面红球手柄把消化管固定在左边托架上，然后按面板上开关分别加入，水和NaOH液体，然后上推蒸汽开关，向试管内注入蒸汽，进行蒸馏样品，在接收瓶内接收液达150ml左右时移下接收瓶，用蒸馏水冲洗滴管口，继续蒸馏半分钟，然后取下接收瓶，待滴定用4.滴定用0.1NHCL滴定接收瓶内的溶液，滴定溶液由绿色变成淡紫色时为止，记下消耗HCL的毫升数，按下列式子计算蛋白质含量：蛋白质含量(%)=(V-V0)N 0.014A 100/W式中 V 消耗HCL的毫升数 V0 空白实验时消耗HCl的毫升数 N HCl的当量浓度 0.014 1mlHCl的克当量数 A 固定系数（6.25,5.7,5.3等） W 试样重量g（空白测定：用0.1g糖代替样品或不加样品做空白测定）四． 注意事项1. 消化时如气体外溢，加大自来水压力。

消化密封圈每次实验结束清晰一遍延长使用寿命2. 如果操作不当，碱泵每天工作完把NaOH溶液外接皮管移入蒸馏水瓶内，前面套好消化管抽洗几次，防止碱浓度过高，残留在碱泵内而影响寿命，也可以防止单项阀阀芯粘连待下次使用时，在蒸馏时须排出100ml NaOH，以防第一个样品NaOH浓度不够过一段时间用稀酸清洗一下蒸发炉并用清水过洗几次，保养电极3. 如果操作不当，15A保险丝烧断后，请拔去电源插头，换上新的后，关水龙头，打开排水夹子排尽蒸发炉水，按照开机调试步骤重新开机操作4. 用户在遵守本仪器的运输，保管，安装和使用规程的条件下，如仪器因制造问题而不能正常工作时，从收货之日起一年内，或开箱时发现包装不良和损坏，附件与装箱单不符，少零件等情况，请与公司质监部门联系。