《培养技术》PPT课件.ppt

第八章 培养技术与过程建模发酵控制目的发酵控制目的v高的发酵水平高的发酵水平v生产过程的稳定生产过程的稳定v成本控制成本控制第一节第一节 微生物微生物发酵类型发酵类型v分类依据分类依据v一、投料方式不同：v二、发酵与氧的关系v三、菌体生长与产物合成之间关系v四、代谢方式不同一、投料方式不同1 1、分批发酵、分批发酵2 2、补料分批发酵、补料分批发酵3 3、连续发酵、连续发酵4 4、半连续发酵、半连续发酵第一节第一节 微生物微生物发酵类型发酵类型1、分批培养是指在一封闭培养系统内具有初始限制量基质的一种发酵方式 特点：v一次性投料，经灭菌、接种后，在发酵过程中不再补料，直到放罐v整个过程中菌浓、营养成分和产物浓度等参数都随时间变化分批发酵中微生物的生长分批发酵中微生物的生长迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳定期稳定期死亡期死亡期迟滞期：菌体没有分裂只有生长，细胞形态变大，菌种进入新环境，细胞内核酸、酶等稀释，细胞不能分裂；对数生长期：细胞内与分裂相关的物质达到一定程度，细胞生长代谢活性最强，细胞开始分裂，呈几何级数增加；稳定期：培养液中营养物减少，废物积累，生长速率下降，生成率等于死亡率，细胞总数最高，细胞开始积累贮存物；死亡期： 细胞死亡率大于生成率，有些细胞开始自溶。

对于初级代谢产物，在对数生长期初期就开始合成并积累；而对于次级代谢产物，则在对数生长期后期和稳定期大量合成分批培养的优缺点优点：操作简单，周期短，染菌机会少，优点：操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量易掌握生产过程和产品质量易掌握缺点：产率低缺点：产率低2、补料分批培养 也称半连续培养、流加培养，它是以分批培养为基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法特点:v一次或多次补入新鲜料液，延长产物合成周期，提高产量；v只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束时发酵液体积比开始时有所增加补料的方式和控制v连续流加、不连续流加、多周期流加；v快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加；v单组分补料和多组分补料等杯式补料系统杯式补料系统补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点Ø基质浓度低，避免快速利用碳源的阻遏效应；Ø避免在培养基中积累有毒代谢物，即代谢阻遏；Ø避免分批发酵中因一次投料过多造成细胞大量生长所引起的不良影响，降低发酵液粘度；Ø维持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧矛盾；Ø可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。

优点：优点：缺点：v没有物料取出，v产物的积累导致生产速率下降；v染菌机会增加3 3、连续培养、连续培养v发酵过程中，一边补入新鲜无菌料液，一边放出等量的发酵液，使发酵罐内的体积维持恒定v达到稳态后，菌体浓度、产物浓度，限制性基质浓度都是恒定的，不随时间而变化连续培养的优缺点优点：Ø发酵条件稳定Ø自动化程度高Ø设备效率高Ø设备使用寿命长Ø易于优化发酵过程缺点 ：Ø易引起菌种退化；Ø染菌机会大大增加；Ø对设备要求高Ø菌体有挂壁和成团问题v 杂菌污染问题v 生产菌株突变问题连续培养过程中的主要问题连续培养过程中的主要问题杂菌污染问题v连续发酵过程中，需要长时间连续不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就不可避免地发生杂菌污染问题v杂菌污染问题是连续培养中难以解决的问题 生产菌株突变问题生产菌株突变问题v微生物在复制过程中难免会出现差错引起突变，如果突变的结果使这一细胞获得在给定条件下高速生长的能力，那么它就有可能像杂菌一样，取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败 4 4、半连续培养、半连续培养在补料分批培养的基础上间歇放掉部分发酵液；四环素发酵常用。

半连续培养的优缺点半连续培养的优缺点v优点：放掉部分发酵液，再补入部分料液，使代谢有害物得以稀释，有利于产物合成，提高产量v缺点：代谢产生的前体物被稀释，提取的总体积增大1、需氧发酵：抗生素、氨基酸等；2、厌氧发酵：乙醇、丙酮、乳酸等二、发酵与氧的关系二、发酵与氧的关系啤酒发酵设备 （厌氧发酵）1、生长关联型发酵2、生长部分关联型发酵3、非生长关联型发酵三、菌体生长与产物合成之间关系三、菌体生长与产物合成之间关系1、生长关联型发酵v产物直接来源于产能的初级代谢，菌体生长、糖的分解和产物的形成几乎是平行的；v单细胞蛋白、葡萄糖酸的发酵 产物的形成和菌体的生长相偶联产物的形成和菌体的生长相偶联xp X（菌体）（菌体） P（产物）（产物）2 2、部分生长关联型发酵、部分生长关联型发酵v第一阶段：菌体生长阶段；v第二阶段：产物合成阶段v柠檬酸发酵 产物的形成和菌体的生长部分偶联产物的形成和菌体的生长部分偶联xp X（菌体）（菌体） P（产物）（产物）3 3、非生长关联型发酵、非生长关联型发酵v第一阶段：菌体生长阶段；v第二阶段：产物合成阶段v抗生素、氨基酸发酵。

 产物的形成和菌体的生长非偶联产物的形成和菌体的生长非偶联xp X（菌体）（菌体） P（产物）（产物）1、初级代谢产物发酵2、次级代谢产物发酵四、代谢方式不同：四、代谢方式不同：v初级代谢：生物细胞在生命活动过程中进行的与菌体的生长、繁殖相关的一类代谢活动v初级代谢产物：微生物合成的主要供给细胞生长的一类物质，如氨基酸、核苷酸、乙醇、有机酸、多羟基化合物、糖类和维生素等注意事项v菌体进入发酵罐，其生长表现出：延迟期、对数生长期、静止期、死亡期等生长史的特征；v对数生长期的菌种移植到与原培养基组成完全相同的新培养基中，就不会出现延迟期；v为了缩短延迟期，宜接种对数生长期（中期）的菌种；v为了获得代谢产物，菌体尚未达到死亡期即行放罐7.2 工业发酵过程的主要控制参数 微生物发酵的生产水平取决于微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特生产菌种的特性性和和发酵条件的控制发酵条件的控制 了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。

人们有效地控制微生物的生长和生产常规的发酵条件：常规的发酵条件：Ø罐温罐温Ø搅拌转速搅拌转速Ø搅拌功率搅拌功率Ø空气流量空气流量Ø罐压罐压Ø液位液位Ø补料补料Ø加糖、油或前体加糖、油或前体Ø通氨速率以及补水等通氨速率以及补水等条件控制条件控制v测定发酵过程中测定发酵过程中数据数据，以便对此过程进行，以便对此过程进行有效的控制有效的控制v具体目的：过程变量与预期是否一致，决具体目的：过程变量与预期是否一致，决定种子罐移种时间与放罐时间，对不可测定种子罐移种时间与放罐时间，对不可测变量进行估计，手动或自动控制，计算机变量进行估计，手动或自动控制，计算机控制，收集控制，收集数据数据表征过程性质的状态参数：vpHpH、溶、溶氧（氧（DODO）、）、溶解溶解CO2CO2、、氧化还原电位、氧化还原电位、尾气尾气O2O2和和CO2 CO2 含量、基质或产物浓度、代含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体浓度、菌浓等谢中间物或前体浓度、菌浓等v间接状态参数：间接状态参数：v比生长速率、摄氧率、释放速率（比生长速率、摄氧率、释放速率（CERCER）、）、呼吸商（呼吸商（RQRQ）、）、基质消耗速率和产物合成基质消耗速率和产物合成速率等。

速率等表征过程性质的状态参数：表征过程性质的状态参数：v物理测量物理测量：温度、压力、体积、流量等v物理化学物理化学：pH、溶氧、溶CO2、氧化还原电位、气相成分分析等v化学测量化学测量：基质、前体、产物等的浓度v生物生化生物生化：生物量、细胞形态、酶活性、胞内成分等v提供反映环境和细胞代谢生理变化的许多信息提供反映环境和细胞代谢生理变化的许多信息检测手段不同检测手段不同v直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数，如温度、pH、残糖等；v间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等发酵参数测定方法的分类v 离线检测离线检测：不安装在发酵罐内，人工取样v 检测检测：自动测定，流动注射分析系统（FIA），（HPLC）或质普仪等v•原位检测原位检测：直接与发酵液接触，给出连续的响应信号，如温度、压力、pH、溶氧等，信号不受操作者干扰，直接输入计算机传感器v和原位检测必须用专门的传感器（也叫电极或探头）放入发酵系统，将发酵的一些信息传递出来，为发酵控制提供依据一些生物传感器一些生物传感器一些生物传感器一些生物传感器: : : :转换器类型转换器类型检测对象检测对象生物学元件生物学元件检测信号检测信号安培计安培计葡萄糖葡萄糖氧化酶H2O2酒精乙醇氧化酶H2O2乳酸乳酸脱氢酶NADH葡萄糖Pseudo. FluorescensO2AMPAMP脱氢酶O2电位计电位计尿素脲酶NH4+GluE.coliCO2青霉素青霉素酶H+热敏电阻热敏电阻Vc抗坏血酸氧化酶热量乙醇醇氧化酶热量带计算机数据采集与控制的反应器带计算机数据采集与控制的反应器P188原理：化学或物理信号原理：化学或物理信号 电信号电信号 放大放大 记录显示仪记录显示仪 控制器（与设定参数比较）控制器（与设定参数比较） 发出调节信号发出调节信号 控制器动作控制器动作一般监控系统测定元件测定元件：如温度计、压力表、电流计、pH计，直接测定发酵过程各种参数，并输出相应信号。

控制部分：控制部分：将测定元件测出的各种信号与预先确定值进行比较，并输出信号指令执行元件进行调整控制执行元件执行元件：接受控制部分的指令，开启或关闭有关阀门、泵等调节控制机构，使有关参数达到预定位置变量变量测量方法测量方法测量原理测量原理温度温度铂电阻电阻随温度变化热敏电阻电阻随温度变化压力压力隔膜直接感受连模压敏电阻电阻随压力变化体积体积压差传感器静压差与液深度正比荷重传感器传感器电阻正比于荷重泡沫泡沫电导或电容探头与液面及电磁阀成回路气体流量气体流量热质量流量计气体带走热与流量成正比液体流量液体流量蠕动泵转速与流量正比连搅拌转速搅拌转速频率计数器频率计数器光反射计数光反射计数转速表转速表感应电流与转速正比感应电流与转速正比pH玻璃电极玻璃电极电极对氢离子特异反应电极对氢离子特异反应溶氧溶氧复膜氧探头复膜氧探头氧在电极转移产生电流氧在电极转移产生电流溶溶CO2CO2探头探头通过扩散引起电解液通过扩散引起电解液pH变化变化粘度粘度旋转黏度仪旋转黏度仪剪应力剪应力/剪速黏度剪速黏度生物量浊度法生物量浊度法入射光细胞散射衰减间歇入射光细胞散射衰减间歇基质和代谢物基质和代谢物HPLC对各成分分析间模对各成分分析间模细胞形态细胞形态射像显微镜射像显微镜显微射像技术显微射像技术发酵是纯培养过程，无菌要求高，发酵是纯培养过程，无菌要求高，对传感器有特殊要求：对传感器有特殊要求：l能经受高压蒸汽灭菌；能经受高压蒸汽灭菌；l结构不能存在灭菌不透的死角，以防染结构不能存在灭菌不透的死角，以防染菌（密封性好）；菌（密封性好）；l对测量参数要敏感，且能转换成电信号。

对测量参数要敏感，且能转换成电信号响应快、灵敏）；（响应快、灵敏）；l性能要稳定，受气泡影响小性能要稳定，受气泡影响小几种常用的检测的传感器几种常用的检测的传感器 lpH电极电极l溶氧电极溶氧电极它们是基础电极，以它们为它们是基础电极，以它们为基础可以制作各种离子电极基础可以制作各种离子电极和酶电极和酶电极实例实例——pH测量测量 传统：传统：pH试纸试纸优点：方便，易操作优点：方便，易操作缺点：主观性较强；缺点：主观性较强； 质量差异大，不同厂家不同批号质量差异大，不同厂家不同批号的的pH试纸测出的试纸测出的pH值差别有时甚至达值差别有时甚至达0.5~1现代：现代：pH电极电极溶氧电极溶氧电极温度传感器、耐高温温度传感器、耐高温pHpH和溶氧传感器和溶氧传感器通气流量计电 子 秤压 力 传 感 器蠕动泵补料测量与控制系统v流速调整幅度大(从0.1ml/h-5L/h)，可变速蠕动泵，占空比可调整的开关控制数字式尾气氧和二氧化碳分析仪数字式尾气氧和二氧化碳分析仪用于过程分析的红外分用于过程分析的红外分析仪析仪带带带带pHpHpHpH测控与补料控制的摇床测控与补料控制的摇床测控与补料控制的摇床测控与补料控制的摇床高效液相（高效液相（HPLC））分析代谢中间产物，通过中间代谢产物的分析代谢中间产物，通过中间代谢产物的测定，可以深入了解微生物代谢的流向，测定，可以深入了解微生物代谢的流向，以此来分析代谢的情况，从而有的放矢的以此来分析代谢的情况，从而有的放矢的控制发酵过程。

控制发酵过程发酵车间安装的质谱仪与微生物发酵有关的参数与微生物发酵有关的参数v物理参数：v化学参数：v生物参数：物理参数：v温度、v压力、v搅拌转速、v搅拌功率、v空气流量、v粘度；化学参数：vPH值、v基质浓度、v溶解氧浓度、v氧化还原电位、v产物的浓度、v废气中氧、v二氧化碳的含量；生物参数：v菌体浓度、v菌丝形态第三节 菌体浓度的影响及其控制微生物如同一个微小的容器，原料中的反应物透过微生物细胞周围的细胞壁和细胞膜进入微生物体内，把反应物转化为产物，接着这些产物又被释放出来；微生物是生物反应过程的催化剂，催化原料转化为有用的产品  微生物的生长现象与繁殖方式微生物的生长现象与繁殖方式类类 别别生长特征生长特征繁殖方式繁殖方式细菌细菌个体增重和增大个体增重和增大分裂繁殖分裂繁殖放线菌、霉放线菌、霉菌菌菌丝伸长和分支菌丝伸长和分支霉霉菌菌--------无无性性孢孢子子、、有有性孢子性孢子酵母菌酵母菌个体增重和增大个体增重和增大出芽生殖出芽生殖放线菌放线菌--------无性孢子无性孢子v微生物的数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响v菌体浓度（菌浓）：指单位体积的培养液中菌体的含量；v一般：前期菌浓增长快，中期菌浓基本恒定，补料会引起菌浓波动，这是衡量补料量适合与否的一个参数。

生长的测定 v微生物生长的测定，通常测群体的重量或细胞数，而不是测细胞个体的重量或大小 v生长测定的常用理化方法，分为测定细胞数和细胞重量两类 1 1、计数法、计数法 v浊度计比浊法：测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数；v计数器计数法：在显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目，以及用细菌计数片直接测出细菌数2、测定细胞重量v细胞干重称量法 直接测定单位体积培养物的细胞干重，由此代表菌体细胞物质总量v细胞堆积容积测量法 用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积 ，由此间接表示细胞重量 v细胞组成分析法 测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间接地算出细胞重量v营养物消耗分析法 测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫酸盐等）的消耗，间接表示细胞重量的生长 v产物重量分析法 测定培养中途形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间接地换算出细胞重量的生长菌丝形态也能反映菌生长情况显微镜观察第四节 营养基质的影响及其控制v发酵液中各种营养物质的浓度，特别是碳氮比、无机盐和维生素的浓度，会直接影响菌体的生长和代谢产物的积累。

v如：半乳糖苷可使大肠杆菌-半乳糖苷酶的产量增加1000倍； 枯草杆菌既产淀粉酶，又产蛋白酶，提供葡萄糖，只产生蛋白酶黑曲霉柠檬酸发酵v蔗糖浓度15%-18%，蔗糖同化率97%；v蔗糖浓度20%，只同化92%；v蔗糖浓度低于10%，产柠檬酸少，积累草酸；v蔗糖浓度低于2.5%，不产柠檬酸v一般在发酵中后期为保证产生次级代谢产物，有意使菌体处于半饥饿状态，在营养限制的条件下，维持产生次级代谢产物的速率在较高水平v对于这种工艺，后期的补料控制是关键一、碳源的影响和控制v迅速利用的碳源——利于菌体生长；v缓慢利用的碳源——利于延长代谢产物的合成糖耗：反映产生菌的生长繁殖情况和产物合成的活力；v糖含量测定包括：v总糖：指发酵液中残留的各种糖的总量如发酵中的淀粉、饴糖、单糖等各种糖v还原糖：指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖葡萄糖效应葡萄糖效应 大肠杆菌培养于含葡萄糖和乳糖的培养基中，出现两次生长旺盛期; 菌先利用葡萄糖生长繁殖,葡萄糖耗尽后，过一段时间菌体才开始利用乳糖; 即使加入乳糖酶诱导物，葡萄糖没耗尽，利用乳糖的酶系也不能合成思考题思考题v乳糖和葡萄糖，谁更适合作为青霉素发酵的碳源，为什么？二、氮源的影响和控制二、氮源的影响和控制v氨基氮：指有机氮中的氮（NH2-N），如氨基酸、黄豆饼粉、花生饼粉中的氮；v氨氮：指无机氨中的氮（NH3-N）。

v迅速利用的氮源——利于菌体生长；v缓慢利用的氮源——利于延长代谢产物的合成补氮工艺补加有机氮源：土霉素——玉米浆 青霉素——尿素补加无机氮源：氨水、硫酸铵 磷是核酸的组成部分，是高能化合物ATP的组成部分，磷还能促进糖代谢因此，磷在培养基中具有非常重要的作用，如果磷缺乏就要采取补磷措施三、磷酸盐的影响和控制三、磷酸盐的影响和控制v适合微生物生长的磷酸盐浓度：0.3～300mmolv适合次级代谢产物合成的磷酸盐浓度：1.0mmol。