基因工程工程菌构建.ppt

1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建,生物技术1101班 李娟,1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大石化新产品之一，其主要功能是作为合成聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体1，3一丙二醇的生产方法有化学合成法和微生物转化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产周期长和转化率低等问题，目前仅有化学合成法应用于工业生产因此，利用基因工程技术构建高产菌株备被认为是今后的发展方向1，3．丙二醇简介,1，3-丙二醇性质,物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l，3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点211℃，自燃温度为400℃ 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐及酸性氯化物生成聚氨酯3一丙二醇最重要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯1，3-丙二醇用途,可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、化妆品和制药等行业14j 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT的原料PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品，产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料,1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标,本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tac-yqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。

1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线,(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建 重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考察其转化甘油的能力 (2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac—dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT (3)在摇瓶水平，对已构建的产1，3．丙二醇重组菌EcoliJMl09 发酵条件的初步研,1，3．丙二醇生物合成途径 l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来甘油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生成1，3一丙二醇 一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达,,1，菌株、质粒及基因片断： 大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠 杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。

2，主要试剂： 质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、,材料,,（一）、质粒DNA的提取 (1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培养过夜 (2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／min离心5 min (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min，离心10min (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀，,6000 r／min离心30s倒掉废液收集管中的废液 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s倒掉废液收集管中的废液重复一次倒掉废液后再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／min离心2min (9)取5“L酶切后电泳鉴定二)、大肠杆菌感受态细胞的制备 (1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过夜。

(2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃振荡培养至OD值O．3—0．4 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌液迅速冷却约10分钟 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中，Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl2400uL，,,轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min （6)重复步骤(5)两次 (7)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL 也可加40 uL50％的甘油保存代用三）、转化大肠杆菌,(1)取出感受态细胞，在冰水中融化 (2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可用漩涡混合仪 (3)冰水浴40min (4)42℃热激90s (5)加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1．2 h (6)涂布含有相应抗生素的LB平板四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建,首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtac-yqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒 pUC．dhaB．tac-yqhD。

将重组表达载体酶切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大肠杆菌JM 109(pEtac—dhaB-tac-yqhD)五）、酶活力测定,1、甘油脱水酶活力的测定 2、1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的酶 活力测定,（六）、1，3．丙二醇含量的测定,,发酵液中l，3：．丙二醇及甘油的含量采用气相色谱测定 ，国产高分子微GDX．401(110目)为固定相柱温：250℃，进样温度：240℃，检测温度t 240℃，氮气作为载气，使用氢火焰检测器，进样5“L，1，3．丙二醇的保留时间为2．7 min左右，用外标法计算发酵液中1，3一丙二醇的含量二、重组质粒pUC—tac-dhaT的构建及其与pEtac—dhaB—tac-yqhD在大肠杆菌JMl09中共表达,实验材料 菌种：E coliJMl09(pEtac-dhaB—tac-yqhD)为本研究“第二章“构建保存的；质粒pUCl9， pEtac由本实验室保藏：dhaT基因从克雷伯氏菌中 试剂和工具酶：质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒 工具酶、抗生素 公司、华美生物 ；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布的序列， 。

引物： 3PCR引物 根据克雷伯氏菌公布的序列，设计片段pEtac．dhaTPCR所需引物：Ps：5’-ACCGCAATTGATGAGCTATCGTATGTTTG一3’： P6：5'-ACC CAGAATGCCTGGCG．3’引物两端均弓l,KmfeI、HindlII酶切位点实验条件和方法 PCR反应体系及反应条件：PCR反应体系：在0 5 mL Eppendorf管中按顺序加入以下试剂：10×buffer 5 m，2 5mmol／LdNTP4lLl，MgCl24IlI，上下游引物各1 IIl，模板DNA2 pl，脚酶1 itl，ddH20 32m，总体积50 pl 1．3一丙二醇氧化还原酶dhaT的反应条件： 94℃预变性5min：变性90 s，54℃退火l 5min，72℃延伸l 5rain，循环35次；72℃保温10min1）大肠杆菌基因工程菌的构建 将来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaT连入载体pEtae，以得到的重组质粒pEtac-dhaT经酶切得到片段tac-dhaT连接到pUCl9上，以得到的重组质粒pUC-tac-dhaT将基因工程菌pUC-tae-dhaT和基因工程pEtac-dhaB-tac-yqhD共转化大肠杆菌KcoliJMl09。

（2） 1，3．丙二醇氧化还原酶的酶活力测定 测定1，3-丙二醇氧化还原酶的酶活酶活测定根据250C条件下NAD+还原成NADH的速率来定量酶活单位定义为1国际单位(1u)等于每分种还原1lJmol底物NAD+或生成1“raol产物NADH的酶量四、重组菌coliJMl09(pEtac—dhaB—tac-yqhD， pUC—tac—dhaT)发酵培养基优化,菌株：重组菌Ecoli JMl09(pEtac．dhaB-tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)为本论文三中构建 培养基和培养条件 LB培养基(∥L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠lO，琼脂15(固体培养基)，固 体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至100}tg／mL、卡那霉素50p．g／mL 种子培养基：采用LB培养基 发酵培养基(g／L)：甘油、酵母膏、KH2P04、MgS04·7H20和维生素B12 青霉素至100Ixg／mL、卡那霉素50rtg／mL材料,摇瓶发酵：从新鲜的LB培养基斜面上挑取一环菌株接入50 mL摇瓶(装液量为10mL)中，于旋转式摇床中37℃、150 r／min培养18 h得到种子液接种于250 mL摇瓶中，在150 r／min旋转式摇床中，先于37。

C培养至OD600为O．7，再于37℃诱导发酵一定时间方法,1、采用单因素实验分别考察了不同浓度的甘油、酵母膏、KH2P04、VBl2及M孑+ 等因素对重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB—tac-yqhD，pUC—tac—dhaT)发酵结果的影响，确 定了其发酵培养基的基本组成为：甘油20g／L、VBl20．01g／L、KH2P047．5edL、M92+0．67 g／L和酵母膏5∥L，在此培养基中l，3一丙二醇的产量达到2．25∥L小结,2、通过正交实验分析法进一步优化了重组菌E coliJMl09(pEtac-dhaB．tac-yqhD， pUC—tac-dhaT)的发酵培养基，其适宜组成为：甘油20 g／L、VBl2 O．01 g／L、KH2P045 g／L、 M92+0．67 edL和酵母膏5∥L最适发酵条件为：装液量10％、接种量10％、转速150 r／min、接种后4d,时左右加入IPTG、IPTG终浓度为lmmol／L应用此培养基l，3．丙二醇 的产量为2．4329／L，,3、在通过正交实验优化后的培养基中，重组菌EcoliJMl09(pEtae—dhaB．tac-yqhD)与E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD，pUC．tac—dhaT)经诱导前后1，3．丙二醇的产量分别为0．3∥L、1．943 g／L及O．3∥L、2．432 g／L。

发酵24小时后，重组菌EcoliJM109(pEtac—dhaB—tac-yqhDDpUC—tac—dhaT)L[',Ecoli JM109(pEtac—dhaB-tac-yqhD)l，3·丙二醇产量提高了25．1％可见，由甘油到1，3-PD的反应，限速步骤是3．羟基丙醛到1，3丙二醇的反应本研究成功构建了在大肠杆菌中利用了两种辅酶(NADH、NADPH)的共表达，减少3．羟基丙醛的累积，提高了1，3-PD的产量。