化学光度分析ppt课件.ppt

第八章第八章 吸光光度法吸光光度法8.1 概述概述8.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理8.3 分光光度计分光光度计8.4 显色反应及影响因素显色反应及影响因素8.5 光度分析法的设计光度分析法的设计8.6 吸光光度法的误差吸光光度法的误差8.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法8.8 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1一一.吸光光度法的特点吸光光度法的特点1、灵敏度高，一般下限：、灵敏度高，一般下限：10-5~10-6mol/L2、分析微量组分准确度高，相对误差：、分析微量组分准确度高，相对误差：2~5%3、应用广泛、应用广泛4、操作简便、快速操作简便、快速吸光光度法吸光光度法吸光光度法吸光光度法 是基于被测物质的是基于被测物质的是基于被测物质的是基于被测物质的分子分子分子分子 对对对对光光光光 具有选择吸具有选择吸具有选择吸具有选择吸收的特性而建立的分析方法收的特性而建立的分析方法收的特性而建立的分析方法收的特性而建立的分析方法第一节第一节 概述概述2二二. .光的基本性质光的基本性质光的电磁波性质光的电磁波性质光的电磁波性质光的电磁波性质  射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光3光的波粒二象性光的波粒二象性波动性波动性波动性波动性粒子性粒子性粒子性粒子性   E E光的折射光的折射光的折射光的折射光的衍射光的衍射光的衍射光的衍射光的偏振光的偏振光的偏振光的偏振光的干涉光的干涉光的干涉光的干涉光电效应光电效应光电效应光电效应E E：光子的能量（：光子的能量（：光子的能量（：光子的能量（J, J, 焦耳）焦耳）焦耳）焦耳）    ：光子的频率（：光子的频率（：光子的频率（：光子的频率（HzHz, , , , 赫兹）赫兹）赫兹）赫兹）    ：光子的波长（：光子的波长（：光子的波长（：光子的波长（cmcm））））c c：光速：光速：光速：光速（（（（2.99792.9979   10101010 cm.s cm.s-1-1））））h h：：：：PlankPlank常数（常数（常数（常数（6.62566.6256   1010-34-34 J.s J.s 焦焦焦焦耳耳耳耳. . . . 秒秒秒秒））））4单色光、复合光、光的互补单色光、复合光、光的互补单色光单色光单色光单色光复合光复合光复合光复合光光的互补光的互补光的互补光的互补单一波长的光单一波长的光单一波长的光单一波长的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。

为互补色光，这种现象称为光的互补为互补色光，这种现象称为光的互补为互补色光，这种现象称为光的互补蓝蓝黄黄紫红紫红绿绿紫紫黄绿黄绿绿蓝绿蓝橙橙红红蓝绿蓝绿5物质的颜色物质的颜色吸收光吸收光 颜色颜色波长范围波长范围(   ,nm)黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿紫蓝绿蓝蓝绿绿黄绿黄橙红400-450450-480480-490490-500500-560560-580580-600600-650650-750三三.物质颜色和其吸收光关系物质颜色和其吸收光关系6物质的颜色与光的关系物质的颜色与光的关系完全吸收完全吸收完全透过完全透过吸收黄色光吸收黄色光光谱示意光谱示意表观现象示意表观现象示意复合光复合光复合光复合光7四四.吸收光谱吸收光谱光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色，这一过程与物质的性质及光的性质有关这一过程与物质的性质及光的性质有关这一过程与物质的性质及光的性质有关这一过程与物质的性质及光的性质有关物质对光的吸收物质对光的吸收物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足物质对光的吸收满足Plank Plank 条件条件条件条件h S2S1S0S3E2E0E1E3h h h 8纯纯纯纯 电子能态电子能态电子能态电子能态 间跃迁间跃迁间跃迁间跃迁S2S1S0S3h E2E0E1E3S2S1S0h A h h h 分子内电子跃迁分子内电子跃迁带状光谱带状光谱锐线光谱锐线光谱锐线光谱锐线光谱 A9a 跃迁类型跃迁类型 价电子跃迁：价电子跃迁：σ→σ*, π→π*; n→σ*, n→π* E (h) 顺序: n→π*<π→π*< n→σ*<σ→σ* 有机化合物的生色原理有机化合物的生色原理b 生色团和助色团生色团和助色团 生色团生色团: 含有含有π→π*跃迁的不饱和基团跃迁的不饱和基团 助色团助色团: 含非键电子的杂原子基团含非键电子的杂原子基团,如如-NH2, -OH, -CH3… 与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强与生色团相连时，会使吸收峰红移，吸收强度增强10吸收光谱曲线：吸收光谱曲线：物质能选择性地吸收某种波长的光，物质能选择性地吸收某种波长的光，但并不是它只对某一波长的光吸收，而对其它波长的但并不是它只对某一波长的光吸收，而对其它波长的光一点不吸收，对任何一种物质，它对任一波长的光光一点不吸收，对任何一种物质，它对任一波长的光都有一定的吸收，只是吸收的程度不同，物质呈现的都有一定的吸收，只是吸收的程度不同，物质呈现的颜色是由最大吸收波长的光的互补光决定的。

颜色是由最大吸收波长的光的互补光决定的 测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长( (   ) )为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度(A)(A)为纵坐标，绘制吸光度随波为纵坐标，绘制吸光度随波为纵坐标，绘制吸光度随波为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱曲线长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱曲线长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱曲线长的变化可得一曲线，此曲线即为吸收光谱曲线11 maxΔ 最大吸收波长最大吸收波长 lmax：：光吸收最大处的波长光吸收最大处的波长对比度对比度(Δ ):络合物最大吸收波长络合物最大吸收波长( MRmax)与试剂最大吸收波与试剂最大吸收波( Rmax)之差之差12第二节第二节 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理一一.光吸收定律－朗伯光吸收定律－朗伯-比尔比尔(Lambert-Beer)定律定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律吸光光度法的理论依据，研究光吸收的最基本定律I0 = Ir + It + IaI0 = It + IaI0IrItIa T = It / I0 , T: 透射比或透光度透射比或透光度 A=lg (I0 / It )＝＝lg(1/T), A:吸光度吸光度朗伯定律（朗伯定律（1760年）：光吸收与溶液层厚度成正比年）：光吸收与溶液层厚度成正比比尔定律（比尔定律（1852年）：光吸收与溶液浓度成正比年）：光吸收与溶液浓度成正比13 当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度）成正比关系－－－朗伯比尔定律比关系－－－朗伯比尔定律 －－－光吸收定律－－－光吸收定律 数学表达：数学表达：A＝＝lg(1/T)=Kbc其中，其中，A:吸光度，吸光度，T:透射比，透射比， K:比例常数，比例常数，b:溶液厚度，溶液厚度，c:溶液浓度溶液浓度注意：注意： 平行单色光平行单色光 均相介质均相介质 无发射、散射或光化学反应无发射、散射或光化学反应14吸收定律的推导吸收定律的推导Lambert – Beer LawLambert – Beer LawI0dbbItII-dIdI dI ∝∝∝∝ N IN IN N ：薄层中的吸光粒子数：薄层中的吸光粒子数：薄层中的吸光粒子数：薄层中的吸光粒子数N N = N = N0 0 c dS dbc dS dbN N0 0 ：阿伏加德罗常数：阿伏加德罗常数：阿伏加德罗常数：阿伏加德罗常数 dS dS ：捕获面积，薄层中光照射的面积：捕获面积，薄层中光照射的面积：捕获面积，薄层中光照射的面积：捕获面积，薄层中光照射的面积c c：吸光溶液的浓度：吸光溶液的浓度：吸光溶液的浓度：吸光溶液的浓度N = k’ c db故故 dI ∝∝ N I = I k’ c dbdI = - I k c db ,dI / I = - k c db积分积分得得或或得得15吸光度吸光度 与透光率与透光率 Absorbance and transmittanceT ：： 透光率透光率A：： 吸光度吸光度1.00.50ACA100500T %TT = 0.0 %T = 0.0 %A = ∞A = ∞T = 100.0 %T = 100.0 %A = 0.0A = 0.0A = 0.434A = 0.434T = 36.8 %T = 36.8 %16二二. .吸光系数吸光系数 Absorptivityb b b b 吸光液层的厚度，光程，吸光液层的厚度，光程，吸光液层的厚度，光程，吸光液层的厚度，光程，cmcmc 吸光物质的浓度吸光物质的浓度, g/L, mol/LK K 比例常数比例常数比例常数比例常数入射光波长入射光波长入射光波长入射光波长物质的性质物质的性质物质的性质物质的性质温度温度温度温度取值与浓度的单位相关取值与浓度的单位相关取值与浓度的单位相关取值与浓度的单位相关c c：：：：mol / Lmol / LK   摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数，摩尔吸光系数， L L · · mol mol –1 –1 · · cm cm -1-1c c：：：：g / Lg / LK  a吸光系数，吸光系数，吸光系数，吸光系数， L L · · g g –1 –1 · · cm cm -1-1c c：：：：g / 100 mLg / 100 mLK 比比比比吸光系数吸光系数吸光系数吸光系数相互关系相互关系 Molar AbsorptivityAbsorptivity Specific extinction coefficient17实际测得的是实际测得的是实际测得的是实际测得的是条件摩尔吸收系数，条件摩尔吸收系数，条件摩尔吸收系数，条件摩尔吸收系数，    ′ ′对摩尔系数的理解之一对摩尔系数的理解之一3 332+桔红色桔红色  508邻二氮菲邻二氮菲  =1.1  104实际测定实际测定实际测定实际测定摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光摩尔吸收系数是对吸光物质而言，是由吸光物质的结构特征，吸光面积等因素决定。

物质的结构特征，吸光面积等因素决定物质的结构特征，吸光面积等因素决定物质的结构特征，吸光面积等因素决定三三三三. . . .灵敏度的表示方法灵敏度的表示方法灵敏度的表示方法灵敏度的表示方法摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数    当当 b = 1 时，时， A =   CAC0 18对同一种待测物质，不同的方法具有不同的对同一种待测物质，不同的方法具有不同的   ，，表明表明具有不同的灵敏度具有不同的灵敏度例，分光光度法测铜例，分光光度法测铜铜试剂法测铜试剂法测 Cu  426 = 1.28   104 L．．mol-1．．cm-1双硫腙法测双硫腙法测 Cu  495 = 1.58   105 L．．mol-1．．cm-1一般情况一般情况  < 104   ~ 104 ~105   > 105低灵敏度低灵敏度中等灵敏度中等灵敏度高灵敏度高灵敏度灵敏度不同的本质灵敏度不同的本质原因是什么原因是什么？？19桑德尔桑德尔(Sandell)灵敏度：灵敏度： S 当仪器检测吸光度为当仪器检测吸光度为0.001时，单位截面积光时，单位截面积光程内所能检测到的吸光物质的最低含量。

程内所能检测到的吸光物质的最低含量 单位：单位： g/cm2 S=M/  20S与与ε的关系：的关系：s=M/ε ε=aM.推导：推导：A＝＝0.001＝＝εbCbC=A/ε=0.001/εC为为mol/L，，b为为cm则：则：bC即为单位截面积光程内的即为单位截面积光程内的mol即：即：mol/1000cm2S=bC/1000×M×106=bCM×103(μg/cm2) =0.001/ε×M×103=M/ε21吸光系数 a比吸光系数比吸光系数比吸光系数比吸光系数Sandell 灵敏度灵敏度 SS S 值表示值表示值表示值表示 单位截面积光程单位截面积光程单位截面积光程单位截面积光程 测得吸光度为测得吸光度为测得吸光度为测得吸光度为 0.001 0.001 时，每时，每时，每时，每mL mL 溶液溶液溶液溶液中待测物质的微克数单位为中待测物质的微克数单位为中待测物质的微克数单位为中待测物质的微克数单位为    g g ．．．．cmcm-2-2。

Sandell 灵敏度与灵敏度与  的关系的关系灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数摩尔吸光系数    22三三.吸光度的加和性吸光度的加和性A1 =  1bc1A2 =  2bc2A =  1bc1+  2bc2 根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及某些化学反应平衡常数的测定某些化学反应平衡常数的测定在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多在某一波长，溶液中含有对该波长的光产生吸收的多种物质，如果各组分间无相互作用，溶液的总吸光度种物质，如果各组分间无相互作用，溶液的总吸光度等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和等于溶液中各个吸光物质的吸光度之和230.575光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示显示显示显示I0It参比参比参比参比样品样品样品样品未考虑吸收池和溶剂对光子的作用未考虑吸收池和溶剂对光子的作用注意注意注意注意比较比较比较比较一一.分光光度计的组成分光光度计的组成第三节第三节 吸光光度计吸光光度计24紫外紫外紫外紫外- - - -可见分光光度计组件可见分光光度计组件可见分光光度计组件可见分光光度计组件光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器样品池样品池样品池样品池检测器检测器检测器检测器信号输出信号输出信号输出信号输出氢灯、氘灯：氢灯、氘灯：氢灯、氘灯：氢灯、氘灯：185~350 nm185~350 nm；；；； 卤钨灯：卤钨灯：卤钨灯：卤钨灯：250~2000 250~2000 nm.nm.基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定。

基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定基本要求：光源强，能量分布均匀，稳定 作用：发出连续光谱作用：发出连续光谱作用：发出连续光谱作用：发出连续光谱作用：将复合光色散成单色光作用：将复合光色散成单色光作用：将复合光色散成单色光作用：将复合光色散成单色光棱镜棱镜棱镜棱镜光栅光栅光栅光栅 玻璃，玻璃，玻璃，玻璃， 350 ~ 2500 350 ~ 2500 nmnm, , 石英，石英，石英，石英，185 ~ 4500 185 ~ 4500 nmnm平面透射光栅，平面透射光栅，平面透射光栅，平面透射光栅， 反射光栅反射光栅反射光栅反射光栅玻璃，光学玻璃，石英作用：盛放试液玻璃，光学玻璃，石英作用：盛放试液玻璃，光学玻璃，石英作用：盛放试液玻璃，光学玻璃，石英作用：盛放试液作用：将光信号转换为电信号，并放大作用：将光信号转换为电信号，并放大作用：将光信号转换为电信号，并放大作用：将光信号转换为电信号，并放大光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄光电管，光电倍增管，光电二极管，光导摄像管（多道分析器）像管（多道分析器）像管（多道分析器）像管（多道分析器）表头、记录仪、屏幕、数字显示。

作用：把放表头、记录仪、屏幕、数字显示作用：把放表头、记录仪、屏幕、数字显示作用：把放表头、记录仪、屏幕、数字显示作用：把放大后的信号以大后的信号以大后的信号以大后的信号以A A或或或或T T的方式显示和记录下来的方式显示和记录下来的方式显示和记录下来的方式显示和记录下来25单波长单光束分光光度计单波长单光束分光光度计光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示显示显示显示26比值比值光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示显示显示显示光束分裂器光束分裂器光束分裂器光束分裂器单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计272829 第四节第四节 显色反应及影响因素显色反应及影响因素要求：要求：a. 选择性好选择性好b. 灵敏度高灵敏度高 (ε>104)c. 产物的化学组成稳定产物的化学组成稳定d. 化学性质稳定化学性质稳定e. 反应和产物有明显的颜色差别反应和产物有明显的颜色差别 (  >60nm)没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量生成有色化合物再测定－－生成有色化合物再测定－－ 显色反应显色反应一一.显色反应显色反应30显色反应显色反应显色反应显色反应有机物质有机物质有机物质有机物质官能团强吸收官能团强吸收官能团强吸收官能团强吸收直接测定直接测定UV-VIS官能团弱吸收官能团弱吸收官能团弱吸收官能团弱吸收衍生化反应衍生化反应UV-VIS显色反应显色反应无机物质无机物质无机物质无机物质通常通过显色反应生成吸光系数大的有色通常通过显色反应生成吸光系数大的有色通常通过显色反应生成吸光系数大的有色通常通过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度物质进行测定，以提高灵敏度物质进行测定，以提高灵敏度物质进行测定，以提高灵敏度3 332+桔红色桔红色  max邻二氮菲邻二氮菲31络合反应络合反应氧化还原反应氧化还原反应二二.显色反应类型显色反应类型32离子缔合反应离子缔合反应成盐反应成盐反应 33褪色反应褪色反应 Zr(IV)-偶氮胂偶氮胂III络合物测定草酸络合物测定草酸吸附显色反应吸附显色反应 达旦黄测定达旦黄测定Mg(II),Mg(OH)2吸附达旦黄呈红色吸附达旦黄呈红色 34三三.显色剂显色剂无机显色剂无机显色剂: 过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾过氧化氢，硫氰酸铵，碘化钾有机显色剂：有机显色剂： 偶氮类：偶氮胂偶氮类：偶氮胂III35三苯甲烷类三苯甲烷类 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料 铬天菁铬天菁S S 三苯甲烷碱性染料三苯甲烷碱性染料 结晶紫结晶紫 36邻菲罗啉类：新亚铜灵邻菲罗啉类：新亚铜灵 肟类：丁二肟肟类：丁二肟 37四四. 多元络合物多元络合物混配化合物混配化合物 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸 V-PAR-H2O 离子缔合物离子缔合物 AuCl4--罗丹明B金属离子金属离子-配体配体-表面活性剂体系表面活性剂体系 Mo-水杨基荧光酮-CTMAB 38酸度的影响酸度的影响酸度的影响酸度的影响副反应副反应副反应副反应M + nR = MRnOH-H+存在型体的变化存在型体的变化存在型体的变化存在型体的变化RH = R- + H+  1 2生成不同配比的络合物生成不同配比的络合物生成不同配比的络合物生成不同配比的络合物例，磺基水杨酸例，磺基水杨酸例，磺基水杨酸例，磺基水杨酸 – Fe – Fe 3+3+pH = 2 ~ 3pH = 2 ~ 3FeRFeR紫红色紫红色紫红色紫红色pH = 4 ~ 7pH = 4 ~ 7FeRFeR2 2橙色橙色橙色橙色pH = 8 ~ 10pH = 8 ~ 10FeRFeR3 3黄色黄色黄色黄色五五. 影响显色反应的因素影响显色反应的因素1. 酸度的影响酸度的影响39适宜适宜pH范围范围作作 A ~ pH 曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜 pH 范围。

范围ApH402.显色剂的用量显色剂的用量M + nR = MRn定量反应定量反应实际工作中，作实际工作中，作 A ~ CR 曲曲线，寻找适宜线，寻找适宜 CR 范围ACR413.温度的选择温度的选择实际工作中，作实际工作中，作 A ~ T 曲线，寻找适宜曲线，寻找适宜 反应温度反应温度ATATATATAT4. 4.反应时间的选择反应时间的选择反应时间的选择反应时间的选择实际工作中，作实际工作中，作 A ~ t 曲线，曲线，寻找适宜寻找适宜 反应时间反应时间425. 溶剂溶剂6.干扰离子干扰离子 有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率有机溶剂，提高灵敏度、显色反应速率消除办法：消除办法： 提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态提高酸度，加入隐蔽剂，改变价态 选择合适参比选择合适参比 褪色空白褪色空白(铬天菁铬天菁S测测Al，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰，氟化铵褪色，消除锆、镍、钴干扰) 选择适当波长选择适当波长 43第五节第五节 光度分析法的设计光度分析法的设计1. 选择显色反应选择显色反应2. 选择显色剂选择显色剂3. 优化显色反应条件优化显色反应条件4. 选择检测波长选择检测波长5. 选择合适的浓度选择合适的浓度6. 选择参比溶液选择参比溶液7. 建立标准曲线建立标准曲线测量条件选择测量条件选择44一一. 测定波长选择测定波长选择选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”灵敏度灵敏度选择性选择性45二二. 测定浓度控制测定浓度控制控制浓度控制浓度 吸光度吸光度A：：0.2～～0.8减少测量误差减少测量误差46三三.参比液的选择参比液的选择原则：原则：原则：原则：扣除非待测组分的吸收扣除非待测组分的吸收扣除非待测组分的吸收扣除非待测组分的吸收以显色反应为例进行讨论以显色反应为例进行讨论以显色反应为例进行讨论以显色反应为例进行讨论M + R = M + R = M-R M-R    maxmax试液试液试液试液 显色剂显色剂显色剂显色剂 溶剂溶剂溶剂溶剂 吸光物质吸光物质吸光物质吸光物质 参比液组成参比液组成参比液组成参比液组成无吸收无吸收无吸收无吸收无吸收无吸收无吸收无吸收光光光光学学学学透透透透明明明明溶剂溶剂溶剂溶剂基质吸收基质吸收基质吸收基质吸收无吸收无吸收无吸收无吸收吸收吸收吸收吸收不加显色剂的试液不加显色剂的试液不加显色剂的试液不加显色剂的试液无吸收无吸收无吸收无吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收显色剂显色剂显色剂显色剂基质吸收基质吸收基质吸收基质吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收吸收显色剂显色剂显色剂显色剂 + + 试液试液试液试液 + + 待待待待测组分的掩蔽剂测组分的掩蔽剂测组分的掩蔽剂测组分的掩蔽剂若欲测若欲测若欲测若欲测 M-R M-R 的吸收的吸收的吸收的吸收   maxmaxA A （样）（样）（样）（样） = A = A （待测吸光物质）（待测吸光物质）（待测吸光物质）（待测吸光物质） + + A A （干扰）（干扰）（干扰）（干扰）+ A + A （池）（池）（池）（池）A A （参比）（参比）（参比）（参比） = = A A （干扰）（干扰）（干扰）（干扰）+ A + A （池）（池）（池）（池）47四四. 标准曲线制作标准曲线制作理论基础：朗伯理论基础：朗伯-比尔定律比尔定律 相同条件下相同条件下测定不同浓度标准测定不同浓度标准溶液的吸光度溶液的吸光度AA～～c 作图作图48第六节第六节 吸光光度法的误差吸光光度法的误差非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移物理化学因素：非均匀介质及化学反应物理化学因素：非均匀介质及化学反应吸光度测量的误差吸光度测量的误差 对朗伯对朗伯-比尔定律的偏移比尔定律的偏移49一一. 非单色光引起的偏移非单色光引起的偏移复合光由复合光由 1和和 2组成，对于浓度不同的溶液组成，对于浓度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。

起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲 50假设混合入射光是由假设混合入射光是由λ1和和λ2组成，溶液对组成，溶液对λ1和和λ2的吸的吸收都符合比耳定律，则：收都符合比耳定律，则：对对λ1：：A1=lgI01/I1=ε1bC，， I1= I0110-ε1bC；；对对λ2：：A2=lgI02/I2=ε2bC，， I2= I0210-ε2bC测定时总入射光为测定时总入射光为I01 +I02，总透过光为，总透过光为I1 +I2，，A=lg(I01+I02)/( I1+I2)=lg(I01+I02)/( I0110-ε1bC+ I0210-ε2bC).当当ε1=ε2=ε时，时，A=εbC，，A与与C成线性关系，若成线性关系，若ε1≠ε2≠ε则则A与与C不成线性关系相差越大，偏离越严重不成线性关系相差越大，偏离越严重 51非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致线性关系上弯吸光度增加，导致线性关系上弯二二. 物理化学因素物理化学因素离解、缔合、异构等离解、缔合、异构等如：如：Cr2O72-+H2O-=2HCrO4-=2H++2CrO42- PAR的偶氮－醌腙式的偶氮－醌腙式 化学反应化学反应52化学反应的影响化学反应的影响M + L = ML  max吸光定律吸光定律光度法测定通常在一个较大的浓度范围内作工作曲线，当光度法测定通常在一个较大的浓度范围内作工作曲线，当光度法测定通常在一个较大的浓度范围内作工作曲线，当光度法测定通常在一个较大的浓度范围内作工作曲线，当    ′ ′或随着浓度的变化而变化，或随着副反应的变化而变化时，或随着浓度的变化而变化，或随着副反应的变化而变化时，或随着浓度的变化而变化，或随着副反应的变化而变化时，或随着浓度的变化而变化，或随着副反应的变化而变化时，就表现出对吸光定律的偏离。

就表现出对吸光定律的偏离就表现出对吸光定律的偏离就表现出对吸光定律的偏离实际计算实际计算例：例： M + LM + L → → MLML , , MLML2 2, , MLML3 3 1  1 2  2 3  3如果在如果在如果在如果在    1 1 进行测定，结果如左图所示进行测定，结果如左图所示进行测定，结果如左图所示进行测定，结果如左图所示AC(M) AMLML2ML3 1ML3ML2ML53例，聚合引起的对吸光定律的偏离例，聚合引起的对吸光定律的偏离2 max = 660 nm二聚体：二聚体： max = 610 nmAC max = 660 nm单体：单体：A 660 nm610 nm54三三三三. .仪器测量误差仪器测量误差仪器测量误差仪器测量误差根据误差传递公式，可以推导出浓度测量的相对误差为根据误差传递公式，可以推导出浓度测量的相对误差为T = 0.368 = 36.8 %A = 0.434 为了使测量误差为了使测量误差 < 5%，，控制溶液的透光率控制溶液的透光率 T = 70 ~ 10 %dc/c(%)T(%)dT=2%dT=1%dT=0.1%当当当当dT = 1%dT = 1%时时时时误差最小误差最小误差最小误差最小A = 0.155 ~ 1.00A = 0.155 ~ 1.0055仪器测量误差公式推导仪器测量误差公式推导吸光定律吸光定律根据误差传递公式，有根据误差传递公式，有 又又得得浓度测量的浓度测量的相对偏差相对偏差得得T = 0.368 = 36.8 %A = 0.434 此时，此时，仪器测量误差最小仪器测量误差最小令令56一一.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的准确度和精密度目的：提高光度分析的准确度和精密度 解决高解决高(低低)浓度组分浓度组分(i.e. A在在0.2~0.8以外以外)问题问题分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分类：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法精密差示吸光度法特点：特点： 以标准溶液作空白以标准溶液作空白原理：原理： A相对相对 =  A =  bcx-  bc0=  b  c准确度：读数标尺扩展准确度：读数标尺扩展, 相对误差减少相对误差减少, c0愈接近愈接近cx, 准确度提高愈显著准确度提高愈显著第七节第七节 常用的常用的吸光光度法吸光光度法57示差光度法示差光度法方法比较方法比较常规法常规法以空白溶剂为参比以空白溶剂为参比示差法示差法以浓度为以浓度为 CsCs 的的标准溶液为参比标准溶液为参比A△△C△△CxA′（（Cx > Cs））适宜适宜 高高 浓度的测定浓度的测定思考：（思考：（Cx   Cs）时情况怎样）时情况怎样？？58示差法的误差示差法的误差方法方法方法方法定量原理定量原理定量原理定量原理相对误差相对误差相对误差相对误差常规法常规法常规法常规法示差法示差法示差法示差法∴∴ Tr > Tx∵∵ I0 > Is有有结论：示差法提高了准确度结论：示差法提高了准确度结论：示差法提高了准确度结论：示差法提高了准确度59例题例题已知已知 dT = 0.01, 样品样品Tx = 2.00 %, 标准标准 Ts = 10.0 %示差法示差法常规法误差常规法误差示差法误差示差法误差已知已知 dT = 0.01, 样品样品Tx = 2.00 %, 标准标准 Ts = 5.00 %60示差法提高准确度的实质示差法提高准确度的实质常规法常规法常规法常规法TxT0 5 1050100 落在测量落在测量误差误差较较 大大 的范围的范围示差法示差法示差法示差法T0 5 1050100TrTsTs 落在测量落在测量落在测量落在测量误差误差误差误差较较较较 小小小小 的范围的范围的范围的范围结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度61二二.双波长吸光光度法双波长吸光光度法 目的：解决浑浊样品光度分析目的：解决浑浊样品光度分析 消除背景吸收的干扰消除背景吸收的干扰 多组分同时检测多组分同时检测 原理：原理：   A = A 1-A 2 = （（  1-   2））b c 波长对的选择：波长对的选择： a.等吸光度点法，等吸光度点法，b.系数倍率法系数倍率法62选选 1为参比波长为参比波长,  2为测量波长为测量波长得得 A 1=   x 1bcx +   y 1bcy A 2=   x 2bcx+   y 2bcy ΔA=A 2-A 1= (  xλ2bcx+  y 2bcy)-(  x 1bcx+  y 1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G, F),   y 2＝＝   y 1，则上式成为，则上式成为 ΔA=(  x 2-   x 1））bcx ΔA与与cx成正比成正比, 可用于测定可用于测定例例,苯酚与苯酚与2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合物中混合物中苯酚苯酚(x)的双波长分光光度法测定。

的双波长分光光度法测定63三三.导数吸光光度法导数吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干扰去除背景干扰 原理：原理： dnA/d n ~  64第八节第八节 吸光光度法的应用吸光光度法的应用一一.测定弱酸和弱碱的离解常数测定弱酸和弱碱的离解常数 AHB和AB-分别为有机弱酸HB在强酸和强碱性时的吸光度，它们此时分别全部以[HB]或[B-]形式存在HB ＝＝H+ + B- [H+][B-]Ka = [HB]pKa=pH+ lg [HB][B-]A=AHB+AB-pKa=pH+ lg AB- - AA- AHBlg AB- - AA- AHB对对pH作图即可求得作图即可求得pKa 65二二.络合物的组成及稳定常数的测定络合物的组成及稳定常数的测定1.摩尔比法测络合比（饱和法）摩尔比法测络合比（饱和法）M + nR = MRnCM, 固定；固定；CR, 从从 0 开始增大开始增大CMRnCR在特定波长测定在特定波长测定 R = 0,  M = 0, MRn >0ACR/CMn R > 0,  M > 0, MRn =0ACR/CMn662.等摩尔连续变化法（等摩尔连续变化法（Job）测络合比）测络合比M + nR = MRnC CMM+ + C CR R = = 常数常数常数常数C CM M / C / C 从从从从 0 →10 →1在特定波长测定在特定波长测定在特定波长测定在特定波长测定 R = 0,  M = 0, MRn >000.51.0ACM / C0.330.33n = 1, n = 1, C CM M / / C C =0.5 =0.5n = 2, CM / C =0.3300.51.0ACM / C R > 0,  M > 0, MRn =0CM / C =0.5，， n = 1 673.3.条件稳定常数的测定条件稳定常数的测定00.51.0ACM / CA′A′< A0由于络合物离解引起由于络合物离解引起由于络合物离解引起由于络合物离解引起离解度离解度离解度离解度MR = R + M总浓度总浓度总浓度总浓度 c c平衡浓度平衡浓度平衡浓度平衡浓度c(1-a)caca将将将将代入上式便可求出络合物的条件稳定常数代入上式便可求出络合物的条件稳定常数代入上式便可求出络合物的条件稳定常数代入上式便可求出络合物的条件稳定常数A068三三.微量组分的测定微量组分的测定1.单组分的测定单组分的测定2.多组分的测定多组分的测定A XY 1 2原理：吸光度的加合性原则原理：吸光度的加合性原则原理：吸光度的加合性原则原理：吸光度的加合性原则解联立方程，可求得解联立方程，可求得解联立方程，可求得解联立方程，可求得CxCx, , CyCy    为物质的特征参数，可通过配制标为物质的特征参数，可通过配制标为物质的特征参数，可通过配制标为物质的特征参数，可通过配制标准溶液测得。

准溶液测得准溶液测得准溶液测得纯物质或共存物质不干扰，纯物质或共存物质不干扰，A＝＝εεbCbC69。