微生物检测方法USP.docx

< 6 1 > 非 无 菌 产 品 微 生 物 检 查 ： 微 生 物 计 数 检 查简介：下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进展定量计数该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准当以此为目的时，依据下面给出的规定进展，包括所需的样品数量以及依据下文规定的要求对结果进展描述此方法不适用于用活微生物作为活性成分的产品假设使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应供给其等同于药典方法的证明一般程序为了避开外来微生物的影响，必需在设定的条件下进展微生物检查为避开此污染所实行的预防措施必需不影响所要进展检查的微生物假设待测样品具有抗微生物活性，则在可能的状况下，移除或中和这种抗微生物活性假设因此而是用了钝化剂，则必需证明其有效性及对微生物无毒性假设在处理样品时使用了外表活性剂，必需证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性计数方法用薄膜过滤法和平皿计数法最大机率法〔MPN〕一般来说最不准确的微生物计数方法但是对于生物负荷格外小确实定的产品来说可能是最适合的方法对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素所选择的方法必需能够用足够的样品来推断出其是否符合标准规定。

必需证明所选择的方法的适用性生长促进试验、计数方法的适用性和阴性比照一般原则必需证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物假设在检测过程中有了转变或会影响检测结果的产品的转变，则必需证明其适用性测试菌株的预备10用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法预备测试菌株使用菌种培育维护技术〔菌种系统〕，以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于 5 个片段依据表 1 中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进展培育用 PH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液或 PH 7.2 磷酸盐缓冲液来配制测试混悬液；制备 A. brasiliensis 孢子混悬液，可参与 0.05%的聚山梨酯 80在 2 小时内使用该混悬液或假设在 2°－8° 储存则在 24 小时内使用作为一种替代的方法，可以配制并稀释植物细胞 A. brasiliensis 或 B. subtilis de 颖混悬液，配制一份孢子的稳定混悬液，然后用适量的此孢子混悬液进展接种此稳定的孢子混悬液可在 2°－8°在验证过的一段时间内保存阴性比照为了确认检测条件，用稀释剂代替样品溶液进展阴性比照阴性比照必需没有微生物生长在检测“产品检测”项下描述的产品时也需要进展阴性比照，阴性比照失败需进展调查。

培育基生长促进对每一批预备好的培育基和每一批由脱水培育基或原料制成的培育基进展检测在大豆酪蛋白消化肉汤和大豆酪蛋白消化琼脂局部/培育皿上接种表 1 中规定的少量微生物〔不大于 100CFU〕，每种培育基使用单独的局部/培育皿在沙氏葡萄糖琼脂培育皿中接种表 1 中规定的少量微生物〔不大于 100CFU〕，每种培育基使用单独的局部/培育皿依据表 1 中的规定进展培育表 1.检测微生物的预备和使用生长促进产品中计数方法的适用性微生物 测试菌株需气菌总霉菌和酵需 气 菌 总 霉菌和酵母的预备数母菌总数数 菌总数金黄色葡萄球 大豆酪蛋菌 ， 如 白消化琼ATCC6538 、 脂或大豆大豆酪蛋白消化琼脂和大豆大 豆 酪 蛋白 消 化 琼脂/MPN 大微生物测试菌株的预备生长促进需气菌总数霉菌和酵母菌总数产品中计数方法的适用性需 气 菌 总 霉菌和酵母数 菌总数NCIMB9518、酪蛋白消酪蛋白消豆 酪 蛋 白CIP4.83 、 或化肉汤化肉汤消化肉汤NBRC1327630°-35°≤100CFU≤100CFU18-24小30°-35°30°-35°时≤3 天≤3 天绿脓杆菌， 如大豆酪蛋大豆酪蛋大 豆 酪 蛋ATCC902 、白消化琼白消化琼白 消 化 琼NCIMB8626、脂或大豆脂和大豆脂/MPN 大CIP82.118 或酪蛋白消酪蛋白消豆 酪 蛋 白NBRC13275化肉汤化肉汤消化肉汤30°-35°≤100CFU≤100CFU18-24小30°-35°30°-35°时≤3 天≤3 天枯草芽孢杆菌，大豆酪蛋大豆酪蛋大 豆 酪 蛋如 ATCC6633、白消化琼白消化琼白 消 化 琼NCIMB8054、脂或大豆脂和大豆脂/MPN 大CIP52.62 或酪蛋白消酪蛋白消豆 酪 蛋 白NBRC3134化肉汤化肉汤消化肉汤30°-35°≤100CFU≤100CFU18-24 小 30°-35° 30°-35°生长促进产品中计数方法的适用性微生物测试菌株需气菌总霉菌和酵需 气 菌 总 霉菌和酵母的预备数母菌总数数 菌总数时≤3 天≤3 天白色念珠菌，如沙氏葡萄大豆酪蛋沙氏葡萄大 豆 酪 蛋 沙氏葡萄糖ATCC10231 、糖琼脂或白消化琼糖琼脂白 消 化 琼 琼脂NCPF3179 、沙氏葡萄脂≤100CFU脂 ≤100CFUIP48.72 或糖肉汤≤100CFU20°-25°≤100CFU 20°-25°NBRC159420°-25°30°-35°≤5 天30°-35° ≤5 天2-3 天≤5 天≤5 天MPN: notapplicable黑曲霉菌， 如沙氏葡萄大豆酪蛋沙氏葡萄大 豆 酪 蛋 沙氏葡萄糖ATCC16404 、糖琼脂或白消化琼糖琼脂白 消 化 琼 琼脂IMI149007 、马铃薯葡脂≤100CFU脂 ≤100CFUIP1431.83 或萄糖琼脂≤100CFU20°-25°≤100CFU 20°-25°NBRC945520 ° -25 °30°-35°≤5 天30°-35° ≤5 天5-7 天或直到有好≤5 天≤5 天MPN: not的芽孢形成applicable对于固体培育基，由一个大于 2 的因子和由标准化接种物计算值得到的增长必需一样。

对于制备的接种物，微生物的生长状况应当和之前一批经过检测并验证的培育基的状况相比较假设与之前一批经过检测并验证的培育基的状况相比较，微生物的生长状况是明显可见的，那么液体培养基亦适用制备样品产品中计数方法的适用性制备样品的方法取决于待测品的物理性质假设以下程序均不能到达令人满足的效果，则应开发其他替代的程序水溶性待测样品：在 PH7.0 的氯化钠-蛋白胨溶液、PH7.2 的磷酸盐缓冲液或大豆酪蛋白消化肉汤中溶解或稀释〔通常预备 1：10 的稀释液〕待测样品，将 PH 值调整至 6-8假设需要进一步稀释， 应使用一样的稀释剂不溶于水的非脂肪性样品：在 PH7.2 磷酸盐缓冲液，PH7.0 的氯化钠蛋白胨缓冲液或大豆酪蛋白酶消化肉汤中制备待测品混悬液〔通常按 1：10 稀释〕，可参与例如 1g/L 的聚山梨酯这一类外表活性剂来帮助亲水性差的物质形成悬液假设需要调整 PH 到 6-8假设需要，可用同样的稀释剂进一步稀释脂肪性产品：用经过除菌过滤后的肉豆蔻酸异丙酯溶解样品，或将样品与最小需要量的无菌聚山梨酯 80 或其他加热后的无菌的无抑制性的外表活性剂混合，假设需要加热，温度应不超过 40°，对特别的产品，应不超过 45°。

留神混合，假设需要在水浴中保持此温度参与足够量的用预热过的稀释剂进展 1:10 稀释后的待测样品留神混合，直至形成乳状液用含有适量无菌聚山梨酯 80 或其他非抑制性的外表活性剂的稀释剂进展连续的十倍稀释气溶胶中的液体或固体：在无菌条件下将待测样品转移至薄膜过滤器或无菌的容器中以进展进一步的取样使用全部或者每个容器中计算出的剂量作为样品透皮贴剂：移除透皮贴剂的保护层，将其放置在无菌的玻璃或塑料盘中，有粘性的一面对上，用一层能透气的盖住透皮贴剂的粘性外表以防其粘在一起，然后将贴剂转移到适量的含有像聚山梨酯80 和/或卵磷脂等钝化剂的稀释剂中，大力振摇至少 30 分钟接种和稀释向按上述方法制备的样品及比照中〔无待测样品〕参与适量的微生物混悬液以得到不大于100CFU 的接种物接种物的体积应不大于稀释的待测样品的体积的 1%为了证明待测样品中可承受的微生物的回收率，必需用样品的最低可能稀释因子进展检测假设由于抗微生物活性或者溶解性差而无法用样品的最低可能稀释因子进展检测，则必需寻求其他适宜的方案假设不能避开对样品生长的抑制，在中和、稀释或过滤后应参与等分的微生物混悬液中和/移除抗微生物活性依据“接种和稀释”的规定进展稀释的样品中微生物的回收率及依据“产品中微生物的回收率” 进展培育，与比照中微生物的回收率进展比较：假设生长被抑制〔由于因子大于 2 而降低〕，则变更该计数检测方法的程序以保障结果的有效性。

变更的程序可包括，例如：（1） 增加稀释剂或培育基的体积；（2） 将特定的或一般的中和剂混入稀释剂中；（3） 薄膜过滤；上述措施结合中和剂：中和剂用中和样品中的抗微生物活性〔见表 1〕最好在灭菌前将其参与到所使用的稀释剂或培育基中假设使用了中和剂，必需做一个有中和剂无样品的空白来证明中和剂的有效性及其对微生物无毒性表 2. 干扰物质的中和剂/方法干扰物质潜在的中和剂/方法戊二醛、汞制剂亚硫酸氢钠酚醛树脂、醇类、醛、山梨酸酯稀释剂醛糖胶季铵盐化合物〔 QACs〕、对羟基苯甲酸 卵磷脂酯、二双胍类季铵盐化合物〔QACs〕、碘、尼泊金类聚山梨醇酯汞制剂硫胶质汞制剂、卤素、醛六代硫酸盐EDTA镁或钙离子假设没有适宜的中和方法，可以假设已接种微生物的分别失败是由于产品的微生物活性这些信息说明样品不简洁被给出的微生物污染但是，有可能这种产品只抑制了一些在此指定的微生物， 但不抑制一些不包含在测试菌株内或不具有代表性的微生物因此，使用与微生物生长和规定的可承受标准相兼容的最大稀释因子进展检测产品中微生物的回收率对列出的每种微生物，应分别进展试验只对参与测试菌株的微生物进展计数薄膜过滤：使用标称孔径不大于 0.45m ，这种过滤器材质的选择是基于细菌保存效率不被待测样品的组分影响这样的理念。

对列出的全部微生物，使用一个薄膜过滤器将依据“样品的预备”、“培育和稀释、”“中和/移除抗微生物活性”所规定的方法制备的适量样品〔大约 1g 样品，假设测定的 CFU 较多的话，可削减样品数量〕移入到薄膜过滤器内，马上过滤，用适量的稀释剂冲洗薄膜过滤器测定需气菌总数〔TAMC〕时，将薄膜过滤器移到大豆酪蛋白消化琼脂外表上测定霉菌及酵母菌总数〔TYMC〕时，将薄膜过滤器移到沙氏葡萄糖琼脂外表上按表 1 的规定进展培育，然后计数平皿计数法：平皿计数法对每中培育基至少用 2 个培育皿进展培育，结果取其平均数注皿法：用直径为 9cm 的皮氏培。