微生物来源的SOD提取分离纯化工艺.ppt

L o g o微生物来源的微生物来源的SOD制备与活力测定制备与活力测定1SOD研究背景研究背景v一种金属酶类一种金属酶类v与细胞的需氧代谢密切相关与细胞的需氧代谢密切相关v存在广泛存在广泛大量数据表明，大量数据表明， 所有需氧细胞包括最简单的所有需氧细胞包括最简单的微生物体微生物体内都含有内都含有SOD迄今人们已分别从细菌、真菌迄今人们已分别从细菌、真菌, 原生动物原生动物, 藻类藻类, 昆虫昆虫, 植植物（如茶叶物（如茶叶, 大豆大豆, 小麦叶片和小白菜等）小麦叶片和小白菜等）, 动物（如肝脏、血液）动物（如肝脏、血液） 等生物材料中分离得到等生物材料中分离得到SOD2v依据依据 SOD分子中所含的金属离子不同，可大致分为以下三分子中所含的金属离子不同，可大致分为以下三类：类：Cu/ Zn-SOD, Mn-SOD, Fe-SOD此外，有研究表明，此外，有研究表明，在牛肝中还发现一种在牛肝中还发现一种Co/Zn- SODv三类三类SOD的性质和存在的性质和存在SOD研究背景研究背景名称名称 金属辅离子金属辅离子 颜色颜色 分子量分子量 λ λmax(nm) max(nm) 存在存在Cu/ Zn-SOD Cu, Zn Cu/ Zn-SOD Cu, Zn 蓝绿色蓝绿色 32000 258, 680 32000 258, 680 主要在真核细胞胞浆内主要在真核细胞胞浆内Mn-SOD Mn Mn-SOD Mn 粉红色粉红色 40000 280, 457 40000 280, 457 主要来自原核细胞主要来自原核细胞 80000 80000 真核生物线粒体真核生物线粒体 Fe-SOD Fe Fe-SOD Fe 黄色黄色 38000 280, 350 38000 280, 350 只存在于原核细胞只存在于原核细胞 3v不同生物材料不同生物材料SOD含量差别很大含量差别很大, 既使同一生物既使同一生物, 不同组不同组织中的织中的SOD含量差别也各不相同。

含量差别也各不相同v 其中以动物肝脏组织中其中以动物肝脏组织中SOD含量最为丰富含量最为丰富 动物来源的动物来源的SOD制备技术也最为成熟，主要是从制备技术也最为成熟，主要是从动物肝脏动物肝脏和和血液血液中中提取v价廉而富含价廉而富含SOD的的植物组织植物组织和和微生物微生物也是制备也是制备SOD的理想的理想原料 SOD研究背景研究背景4vSODSOD是需氧微生物在有氧环境中生存的必要条件，细菌是需氧微生物在有氧环境中生存的必要条件，细菌SODSOD主要是主要是Mn-SODMn-SOD和和Fe-SODFe-SOD，，也有少量细菌中含有也有少量细菌中含有Cu/ Zn-SODCu/ Zn-SODv本实验拟用本实验拟用伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌提取提取SODSOD微生物细胞中微生物细胞中SOD的提取纯化工艺的提取纯化工艺5v提取思路提取思路培养细菌培养细菌微生物细胞中微生物细胞中SOD的提取纯化工艺的提取纯化工艺破壁破壁离心收上清离心收上清盐析盐析溶解目的蛋白溶解目的蛋白阴离子离子交阴离子离子交换色谱换色谱洗脱洗脱6SOD等电点：4-5SOD存在于胞浆微生物细胞中微生物细胞中SOD的提取纯化工艺的提取纯化工艺v具体操作具体操作 伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌37℃，120r/min摇床培养24h4000r/min 离心 5min收集细菌55% 硫酸铵盐析 80%硫酸铵盐析洗3次，悬浮于其中菌体重悬液菌体重悬液超声波法破碎细胞透析液透析液3000r/min 0.05mol/L pH7.8 磷酸钾缓冲液分级沉淀蛋白沉淀蛋白沉淀20mmol/L 磷酸盐缓冲液溶解透析至外液不含NH4+上清液上清液7接种于LB培养基微生物细胞中微生物细胞中SOD的提取纯化工艺的提取纯化工艺依次用不同浓度pH7.8的磷酸钾缓冲液洗脱20mmol/L 100ml, 30mmol/L 100ml, 30-100mmol/L 200ml流速为0.5ml/min洗脱液洗脱液旋转蒸发仪浓缩至1/3倍体积浓缩液浓缩液过DEAE纤维素层析柱（DE-32）DE-32 预先用10mmol/L磷酸钾缓冲液平衡10-100mmol/L 磷酸钾缓冲液100ml活性产物活性产物-30℃保存8透析液透析液过DEAE纤维素层析柱（DE-32）DE-32 预先用20mmol/L磷酸钾缓冲液平衡洗脱v含量测定含量测定---分光光度法分光光度法 Mn-SOD与与Fe-SOD在在λ280nmλ280nm有最大吸收有最大吸收 测测样品样品A280，参考标准酪蛋白在，参考标准酪蛋白在A280处做出的标准曲线，确定浓处做出的标准曲线，确定浓度。

度vSOD酶活测定酶活测定---邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化法 SOD存在下，体系中邻苯三酚自氧化速率降低，自氧化中间产物积存在下，体系中邻苯三酚自氧化速率降低，自氧化中间产物积累减少 连续测定体系的连续测定体系的A420 通过与不含通过与不含SOD的空白组（自氧化速率控制在的空白组（自氧化速率控制在0.060A/min）做比较，）做比较，计算出自氧化速率在计算出自氧化速率在0.030A/min时的酶量，即为一个酶活力单位时的酶量，即为一个酶活力单位 SOD含量测定与活力测定含量测定与活力测定9讨论讨论v 优点：本方法采用硫酸铵分级沉淀提取法，避免了因有机优点：本方法采用硫酸铵分级沉淀提取法，避免了因有机溶剂处理使溶剂处理使SOD失活的缺点而且可以同时分离得到失活的缺点而且可以同时分离得到Mn-SOD与与Fe-SODv不足：整个过程较为复杂，至少需要不足：整个过程较为复杂，至少需要2-3次上柱层析次上柱层析v总结：总结： 从微生物中提取从微生物中提取SOD主要受以下三个方面影响：主要受以下三个方面影响：提提取方法取方法、、菌龄菌龄、、菌种菌种。

因此选取较好的细胞破壁方法，选用处于对数生长期后因此选取较好的细胞破壁方法，选用处于对数生长期后期、期、SOD含量高的需氧单核微生物可以提高收率含量高的需氧单核微生物可以提高收率1011。