ELISA基础知识和注意事项.ppt

ELISA基础知识和注意事项*类容oELISA的基本原理和相关概念o特别说说捕获法oELISA结果的影响因素oELISA结果的处理DateELISA的基本原理和相关概念oo将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或 抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相 应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留 酶的活性酶的活性 oo由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗 原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高 的的敏感性敏感性DateELISAELISA的基本原理的基本原理ØØ抗原或抗体在体外结抗原或抗体在体外结 合到某种固相载体表合到某种固相载体表 面后，仍然能保持其面后，仍然能保持其 免疫学活性而能相互免疫学活性而能相互 特异性特异性结合Date抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下 显色，显色，颜色的深浅颜色的深浅与与特异性抗体水平特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定成比例关系，可进行定性和定 量分析。

量分析DateELISA的分类o测抗原：竞争法（也可用于测抗体）、双抗 体夹心法 o测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法Date竞争法elisao 竞争法ELISAELISA原理原理————标本中的抗原和一标本中的抗原和一 定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本 中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗 原越少，显色越浅原越少，显色越浅oo要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也 可对抗体进行测定可对抗体进行测定Date包被特异性抗体 酶标抗原检测抗原孵育洗涤后显色加样AB竞争法ELISA3.显色3.孵育1.加样Date双抗体夹心法oo双抗体夹心法双抗体夹心法ELISA ——ELISA ——将特异性抗体包将特异性抗体包 被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结 合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与 抗原结合，加入底物后显色抗原结合，加入底物后显色o检测测抗原要有至少具有2个抗原决定簇Date包被特异性抗体双抗体夹心法ELISA检测抗原1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色酶标特异性抗体Date双抗原夹心法oo双抗原夹心法双抗原夹心法ELISA——ELISA——检测标本中的总检测标本中的总 抗体（包括抗体（包括IgMIgM和和IgGIgG型抗体）型抗体） 。

将特异将特异 性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异 性性IgMIgM和和IgGIgG型抗体结合，洗涤后加入酶标型抗体结合，洗涤后加入酶标 的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加 入底物显色入底物显色Date3.洗涤1.加样2.孵育6.显色5.孵育4.加入酶标 抗原双抗原夹心法ELISADate间接法oo间接法间接法 ELISAELISA（（Indirect ELISAIndirect ELISA））———— 将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本 中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标 的抗人的抗人IgGIgG或或IgMIgM抗体与之结合，洗涤后加抗体与之结合，洗涤后加 入底物显色入底物显色o酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子o只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗 检测各种与抗原结合的抗体Date1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色间接法ELISADate捕获法ooELISAELISA（（Capture ELISACapture ELISA））————专门用专门用 来检测来检测IgMIgM型抗体的方法。

将抗人型抗体的方法将抗人IgMIgM抗抗 体包被于固相载体表面，与标本中所有人体包被于固相载体表面，与标本中所有人 IgMIgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相 应的特异性应的特异性IgMIgM抗体结合，洗涤后再加入酶抗体结合，洗涤后再加入酶 标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入 底物显色底物显色Date1.加样2.孵育3.洗涤4.加入抗原 孵育5.加入二抗 孵育6.显色捕获法ELISADate区别理解o 检测抗原？抗体？o 包被什么？ 标记什么？Date间接法和捕获法比较o 间接法：假阴性，假阳性o捕获法：酶标抗体的要求较高Date间接法的假阳性麻疹IgG麻疹 抗原麻疹IgM抗人酶标 IgM抗体类风湿因子阳 性 结 果假 阳 性 结 果Date间接法的假阴性麻疹IgG麻疹 抗原麻疹IgM酶标抗人 IgM抗体阳 性 结 果假 阴 性 结 果DateELISA的有关名词概念o质控血清：质控血清是为了对实验结果进行控制而 配制的血清质控血清可以是定值也可以是不定值 ，可以购置也可以自配自己配制时要注意选用无 脂血的血清或血浆，不能用试剂盒内的阳性对照。

若用稀释的血清作为质控血清，应考虑稀释基质成 分对结果的影响因质控血清与临床标本不一致， 应该注意对结果的分析，应该注意质控血清只能用 于质控活动，不可用于标定仪器或评价方法用于 室内质控的质控血清一般选取CUTOFF值2-3倍 的质控品Dateo室内质控：实验室内部使用控制实验结果可 靠性的一种质量控制o室间质评：用于考核各个实验室结果可靠性 的一种考核，可分为国家级和地方级的室间 质评可以理解为 “各个实验室的质量评比” Dateo临界值（CUTOFF值）：临界值是判断阴阳 性或有临床意义水平的数值，临界值的确定 是测定大量数据后应用统计学方法确定的 许多试剂都会给出临界值或临界值的计算方 法o 本底：就是底色如ELISA HBsAg，阳性 显色，阴性不显色，本底就是整个阴性显色 的情况ELISA 抗–HBcAb，阳性不显色， 阴性显色，本底就是整个阳性显色的情况Dateo灵敏度：能检测到的分析物的最小量，表示 检测下限的能力o相对灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性） ×100%o测定方法及表示方法：灵敏度标准品、质控 血清、阳性标本稀释终点、血清盘（ pannel）及临床标本阳性率。

Dateo特异性： 真阴性标本的检出能力o相对特异性=真阴性/（真阴性+假阳性） ×100%o测定及表示方法：质控血清、血清盘、临床 标本阴性率DateElisa结果的影响因素o 试剂盒的选择 o 标本o 加样与稀释o 温育o 洗版o 显色o 质控Date试剂盒的选择o 同行的试剂使用情况o 上级部门对试剂实际使用的综合评价o 使用临界值质控血清进行实际检测比较,选 择林敏度和准确度高、特异性强试剂盒Date标本o应注意避免溶血 o在5 天内测定的血清标本可放置于4℃、超 过一周测定的需－20℃保存o尽量避免反复冻融（少量分装）Date加样和稀释o 加样本的准确性（个人因素和实验条件）o 尽可能排除主关因素（尽可能用加样枪， 避免直接使用滴瓶）o 各种试剂盒标本的稀释使用，严格按照说 明是操作Date温育o 温度o 水浴箱o 发硬板应漂浮于水上或水面应高于反应板Date洗版o 手洗o 洗板机 （微孔液体残留45s）Date显色o 通常是A、B两种液体，不稳定，又颜色应 立即丢弃o 先加A后加B，显色时间严格按说明书进行o 终止后15内比色Date质控o 室内质控血清o 即刻法DateELISA试剂的常见问题原因及其解决o 显色浅，灵敏度低o 假阳性多，本底高甚至花板o 重复性不好o 白板Date显色浅 灵敏度低序号原因解决方法1试剂盒运输时间过长 ，受高温天气影响，酶的活 性降低。

试剂运输过程加放足够冰袋并尽可能缩短运输时 间2试剂盒（包括未用完的板条及其他组分）保藏条件 不正确试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的 板条要密封保存3试剂盒使用时已超出有效期过期试剂盒不可以使用4温育时间不够严格按照说明书操作5恒温箱温度达不到37℃注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在 37±0.5℃尽量避免频繁开关恒温箱门 经常注意水箱中合适的水位 在保证水不没过酶标板的前提下，使水位尽量高， 以保证反应温度Date6加样量不足；移液时抽吸排放过快， 有气泡、或吸头内残留液体过多 经常校正移液器注意吸头要与移液器 吻合移液不宜过快，排放要完 全7显色剂加量不足，或加入顺序颠倒按照说明书要求，先加入A液、后加入 B液，并保证加入量8样品用NaN3防腐，影响了酶的活性不可以使用NaN3防腐9试剂 、样品使用前未平衡至室温试剂 、样品从低温保藏条件中拿出来 后，要先平衡至室温方可以使用 10试剂 开启时间过长 ，污染试剂 开启后应该 在尽可能短的时间 内 用完，在保证正确贮存的前提最 长不要超过12不同批号试剂 中混用不同批号试剂 不能混用Date假阳性多，本底高甚至花板 序号原因解决方法1试剂过 期过期试剂 不能使用2加样时污 染注意更换吸头。

尽可能避免污染3加酶时污 染对先加样后加酶的操作，加酶时要注 意吸头不要接触标本，造成污染 当可能造成污染时，一定要更 换吸头，切忌侥幸心理4恒温箱温度过高注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定 在37±0.5℃5整个操作时间过长 、造成反应时间 不 同（第一孔与最后一孔反应时间 相差很悬殊）气温高时更明显 在尽可能短的时间 内完成操作 尽量不要堆积多块板子操作（尤其手工 操作时）Date6洗液稀释倍数过高按照要求倍数稀释洗液7洗板次数不够按试剂要求，不可任意减少洗板 次数8洗板时浸泡时间不够按要求操作，并适当延长浸泡时 间9手工洗板方式不正确洗板时，垂直加入洗液，保证一 定的冲击力；洗液要注满板 孔，并保证30-60秒的浸泡时 间 10洗板机调试不正确或者有故障 （可通过手工洗板判定）手工洗板，并联系仪器厂家维修 11酶被污染防止组分的污染如使用容器， 注意容器的清洁12显色液B液被污染13显色完后没有终止反应显色完立即终止反应Date重复性不好 1加样量多少不一，操作时间长 短不一重复同一样品时，加样量与加样时间 相同；同时 注意移液器的校准加样后应该将酶标板放 置在微量振荡器上，充分混合；标本保证一 致、无污染；尽可能由同一名操作人员操作 。

尽可能模拟相同的反应条件2加入标本后没有混匀3重复实验的操作人员不同，操作习惯不同4反应时间 、温度等不相同5标本不同（被混淆或者处理不同）6精密度测定方法不标准采用正确的方法操作Date白板 1忘记加酶严格按照说明书操作2忘记加显色液3酶或A、B液被污染失效防止组分被污染，注意保存4把终止液当A液注意液体组分加样顺序Date结果处理o OD值出现负值o 阴性对照值比空白小o 样本OD值和cutoff接近 DateOD值出现负值o波长不对，酶标仪上显示的波长和实际的滤光片不 对应o溶液里有沉淀o板子脏了，如果有能冲洗的洗板机可以冲洗 bottom，或者洗瓶冲干净用滤纸吸干，然后双波 长检测DateDate。