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实时荧光定量 PCR 卢瑶瑶、黄志聪佘碧芳、李家威 实时荧光定量 PCR技术研究概述 问题 诞生 方法 应用 原理 诞生 实时荧光定量 PCR( real-time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction, RTFQ PCR) 是 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出的一种新定量试验技术，即通常所说 RT-PCR技术 原理 1、非探针类（ SYBR Green I 法） SYBR Green I 是一种结合于双链 DNA 结合染料与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm ，发射波长最大约为 520nm 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步 2、探针类（ TaqMan探针法） 方法 荧光定量PCR 方法的确定 目的基因的 查找和比对 引物、 探针的 合成 1.反应体系的配置 2.反应条件的设定 3.反应体系条件的 优化 待测品的制备 荧光曲线与 标准曲线的 制作 通过标准曲线对 数据进行分析 标准品的制备 引物、探针 的设计 按 荧光产生的原理 有两种方法： 荧光探针法 和 荧光染料法 。

染料法 利用 SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量与常规 PCR类似， 唯一区别 是在反应体系中加入了 SYBR Green染料分子 探针法 ：与常规 PCR的不同之处在于：在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比，提高了实验的特异性目前市场上探针多样，其中以 TaqMan探针 应用最为广泛 荧光素： FAM、 Texas red、 LC-Red640， LC-Red705 等 1、荧光定量 PCR方法和荧光标记素的选择与确定 2、目的基因（ DNA和 mRNA）的查找和比对 ●从 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank中查找并下载所需要的序列 ●通过 BLAST对该目的基因进行对比，找出 保守序列 3、引物的设计与合成： Primer Premier 5.0软件 成 功 4、探针的设计与合成： DNAstar软件中的 Seqman软件 选择 高品质 的引物探针合成商 5、标准品的制备 (1）选择一个已知起始拷贝数（起始模板数）的样品 (2）反应体系的配置 (3）反应条件的设置 (4）反 应体系与条件的优化 2017/5/11 (1)、反应体系的配置 (2)、反应条件的设定 95℃ 预变性 2min ↓ 94℃ 变性 30s ↓ 55-65℃ 退火 30s ↓ 72℃ 延伸 30s ↓ 72℃ 终延伸 5min 扩增 30-40个循环 (3)、反应体系和条件的优化 ♦酶浓度 ♦Mg+浓度 ♦dNTP浓度 ♦上、下游引物浓度 ♦探针浓度 ♦退火温度、退火时间和循环数 ♦DNA模板浓度 6、荧光曲线与标准曲线的制作 通过原理可知： 总的荧光信号 =本底信号 + 分子数 × 单位信号强度 Rn = RB + X0(1+E) × RS 2017/5/11CT Rn = RB+ X0(1+E) × RS 当 n=CT值时，荧光信号强度 的变化的对数全部一致，都达 到了阈值。

RT-RB = X0(1+E) × RS lgX0 CTlg(1+E) =-lgX0 + lg(RT-RB)-lgRS CT × a =-lgX0 + b 7、待测品的制备 将 待测样品 放置在 与标准品相同优化后的体系、条件 下进行 PCR扩增反应 8、通过标准曲线进行数据分析 待测样品的 CT值 可通过标准曲线方程 CT× a=-lgX0+b 求得待测样品的 起始模板数 ,从而达到通过标准曲线对未知模板进行定量分析的效果 荧光 PCR的应用 ●分子生物学的研究 2.基因表达差异分析 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA芯片或差显结果的确证 1.核酸定量分析 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型 H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等 3.SNP 检测 检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦 SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。

4.甲基化检测 甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高 ●医学研究 1.产前诊断 人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少 X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿 DNA，用实时荧光定量 PCR检测其 Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受 2.病原体检测 采用荧光定量 PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、 EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点 3.药物疗效考核 对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。

HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而 HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中， HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异 4.肿瘤基因检测 尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量目前用此方法进行过端粒酶 hTERT基因、慢性粒细胞性白血病 WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌 PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测 关于实时荧光定量 PCR的相关问题 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出 后 , Heid等首先就其原理及方法进行了报道由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃 , 而且与常规 PCR 相比 , 具有很多优点，目前已在动植物基因工程 , 微生物和医学领域中得到广泛应用但不可否认，这种还算“年轻”的技术仍有需要改进的地方 优点 特异性高 ： 荧光探针的使用相当于在 PCR的过程中自动完成了Southern印迹杂交，进一步提高目的基因检测的特异性。

灵敏度高： 光谱技术与计算机技术的联合应用提高了灵度，有效的减少了劳动量，荧光定量 PCR使用氩激光来激发荧光的产生，利用荧光探测仪检测荧光信号，通过计算机进行数据分析灵敏度达到了极限，可以检测到单拷贝的基因这是传统的 PCR难以做到的其灵敏度可检测到 400 个分子的 mRNA 精确： 能够精确定量 对 DNA扩增过程进行监测，由于 PCR扩增效率的差异和平台效应，传统 PCR无法进行精确的 减少污染： 定量而荧光定量 PCR 由于利用扩增进入指数增长期的 Ct值来定量起始模板的数量 实现了精确的核酸定量检测有效地避免了污染，传统的 PCR在扩增结束后需要电泳或紫外光下观测结果，除了易造成污染外，还对人体有害，而荧光实时定量 PCR在闭管状态下实现扩增及产物分析，有效地减少了污染及对人体的危害，在大批量的标本检测中能有效地减少劳动量，提高检测通量和实现快速检测 仍需改进之处  降低探针制备的成本或发掘新的荧光染料  进一步提高分析的灵敏度及实验重复性  样品制备简单化 , 程序化和机械化以节约时间降低成 本。