酶的分离与纯化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 酶的分离与纯化,一、酶的分离,二、酶的精制,三、电泳,四、酶的浓缩,五、酶结晶,一般程序,1.预处理和固液分离：加速固液相分离,2.细胞破碎分离胞内产物,3.初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质,4.高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质,5.产品加工,一、酶的分离,（一）发酵液预处理,目的：,改变发酵液物理性质,尽可能使产物转入便于后处理的某一相中,去除部分杂质,1、发酵液的相对纯化,（1）无机离子的去除,Ca,2+,常用草酸,Mg,2+,三聚磷酸钠，生成可溶性络合物,Na,5,P,3,O,10,+Mg,2+,=MgNa,3,P,3,O,10,+2Na,+,Fe,3+,黄血盐,K,4,Fe(CN),6,形成普鲁,(,Fe,4,Fe(CN),6,3,),沉淀,3,K,4,Fe(CN),6,+4Fe,3+,=Fe,4,Fe(CN),6,3,+12K,+,(2)杂蛋白质的去除,1）沉淀法 机理主要是破坏电荷酸性溶液中与一些阴离子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀碱性溶液中与一些阳离子如,Ag,2+,Cu,2+,Zn,2+,Fe,3+,Pb,2+,等形成沉淀,2）变性法 蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。

常见的如加热、大幅度调,pH、,加有机溶剂和表面活性剂等3）凝聚和絮凝,用,Al,2,(SO,4,),3,等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互碰撞发生凝集形成的颗粒较细絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成10,mm,大小絮凝团的过程形成的颗粒较粗，用量小，速度快4)吸附法,(3)色素及其他物质的去除,活性炭：,0.1-1.5%,离子交换树脂,如,DEAE-,纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋,白质,2、发酵液的固-液分离,离心和过滤,菌种对过滤速度影响很大,真菌容易过滤，放线菌则难,培养基组成对过滤也有影响,（二）细胞破碎,1、细胞壁与细胞破碎,2、细胞破碎的方法,1）机械法：,珠磨法,（,bead mill）,实验室：,Mickle,捣碎机；中试：胶质膜处理；工业：高速珠磨机,高压匀浆法：,大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的,G,+,菌，含有包含体（,Inclusion body）,的基因工程菌不宜用此法,超声波法,（,Ultrasonication）,：,杆菌比球菌容易破碎；,G,-,比,G,+,容易破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？,2）非机械法：酶法、化学法、物理法,化学渗透法,（,chemical permeation）：,改变细胞壁或细胞膜的通透性；,TritonX-100：,结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；,EDTA：,对,G,-,菌外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐酸胍与水中氢键作用。

优点：选择性，易于固液分离缺点：通用性差，效率低，毒性,JJ-2,组织捣碎匀浆机,ZM,系列,卧式密闭珠(砂)磨机,（三）酶的提取,（,extraction,）,1、盐溶液提取：,盐溶（,salting in,）,在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加mol/L）2、,酸、碱溶液提取,3、有机溶剂提取,（四）离心分离,1、离心机种类,(1)常速离心机 最大转速8000,r/min,相对离心力（,RCF)110,4,g,(2),高速离心机 110,4,r/min,转速2.610,4,r/min,810,3,gRCF110,5,g,(3),超速离心机 转速2.510,4,r/min,RCF110,5,g,TGL-16M,高速台式冷冻离心机,2、离心分离方法,（1）差速离心(,differential centrifugation,),（2）,密度梯度离心(,density gradient centrifugation,),（3）,等密度梯度离心(,sendimentation equilibrium,centrifugation,),3、,离心条件,（1）离心力 相对离心力,RCF,=1.1210,-5,rn,2,g,（2）,离心时间,（3）温度和,pH,离 心 条 件,沉 淀 的 亚 细 胞 成 分,1,000,g,5,min,真核细胞,4,000,g,10,min,叶绿体,真核细胞碎片,细胞核,15,000,g,20,min,线粒体,细菌,30,000,g,30,min,溶酶体,细菌菌体碎片,100,000,g,180,min,核糖体,多聚核糖体,用差速离心法分离亚细胞成分,（五）沉淀分离,1、盐析法,盐溶,(,salting in),在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。

盐析,(,salting out),盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出1）盐析法的机制,（2）盐析用中性盐的选择,常用的中性盐：,MgSO,4,、(NH,4,),2,SO,4,、Na,2,SO,4,和,NaH,2,PO,4,（3）,(NH,4,),2,SO,4,饱和度表示法,（,4,）影响,盐析,的因素,1,）蛋白质浓度,2,）,pH,和温度的影响,蛋白质的盐析,盐析,应用最广泛的是硫酸铵,优点,1）溶解度大 25时硫酸铵的溶解度可达4.1,mol/L(541g/L),以上大约每升水可溶解767,g,之多在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以被盐析沉淀出来2）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大例如0时，硫酸铵的溶解度仍可达到3.9,mol/L(515g/L)大约每升水可溶解676,g对于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格低廉，容易获得缺点,铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难NH,4,),2,SO,4,饱和度表,温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。

在无盐或稀盐溶液中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质的溶解度随温度的升高反而减小许多蛋白质在高离子强度溶液中，25时的溶解度比0时明显减小这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升高有利于蛋白质失水沉淀一般盐析时不要降低温度，除非这种酶对温度比较敏感盐析,pH,的选择以不降低酶的活性为原则，通常通过试验选择酶稳定的,pH,范围进行盐析盐析法的优点：操作简便、使用广泛、去杂纯化效果好浓缩作用，有利于进一步纯化缺点：分辨能力差，纯化倍数低得到的蛋白质或酶含大量盐粉，需脱盐后进一步纯化2、有机溶剂法,利用,酶等蛋白质在水溶性有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮）中溶解度降低而使之分离的方法1）有机溶剂沉淀法的,机理,1）,主要效应是降低水溶液的介电常数,(,dielectric constant),介电常数用于衡量绝缘体储存电能的性能介电常数代表了电介质的极化程度，也就是对电荷的束缚能力，介电常数越大，对电荷的束缚能力越强带电离子基团之间的作用力随介电常数的减小而增大带电溶质便互相吸引凝集而沉淀20时介电常数：水80，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4,）,2）,破坏蛋白质表面水膜，而使蛋白质聚集沉淀,。

3）,作为变性剂，破坏蛋白质氢键等化学键,有机溶剂沉淀法,优点：分辨率高；密度低，便于离心分离；沉淀不需脱,盐；溶剂易于蒸发除去，适于食品工业用酶制剂的制备缺点：容易使酶变性失活；安全要求较高；操作必须在,低温下进行2）有机溶剂的选择和用量,与水互溶有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和丙,酮有一定毒性沉淀能力顺序是丙酮乙醇甲醇工业上多用,乙醇作为沉淀剂3）影响有机溶剂沉淀的因素,1）温度,2）,pH,3）,离子强度,4）蛋白质浓度,3、等电点法,(,isoelectric precipitation),4、,其他沉淀法,（六）萃取分离,(,extraction,),概念:,P154,1、,溶剂萃取法 比沉淀分离程度高,比离子交换法选择性好,传质速度快,生产周期段,便于连续操作,容易实现自动化.,2、双水相萃取法,(,Partion of two aqueous phase extraction),用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液进行萃取.,3、超临界流体萃取法,4、反胶团萃取法,双水相萃取法,双水相：,将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混和时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。

如：,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时，就得到一个浑浊不透明的溶液，它随之分成两个液相，这就是双水相体系用于生物分离的高聚物体系有：聚乙二醇(简称,PEG,),葡聚糖(简称,Dextran,),和,PEG,Dextran,硫酸盐体系常见的高聚物无机盐体系为：,PEG,硫酸盐或磷酸盐体系原理：,生物物质在双水相体系中的选择性分配酶、蛋白质等生物大分子的分配系数大致在0.1-10之间)各种双水相系统,双水相系统的应用,二、酶的精制,根据原理,酶的纯化方法分为:,1)沉淀法;2)相分配法;3)柱层析法;4)电泳或离心法酶纯化的基本原则:,1)建立方便灵敏的分析方法;,2)选择有效的纯化方法;,3)尽量避免变性;,4)尽量避免过度暴露于空气中.,酶的理化性质与分离纯化方法,理化性质,分离及纯化方法,分子大小和形态,溶解度,电荷差异,生物功能专一性,差速离心、超滤、分子筛、透析,盐析、萃取、分配层析、结晶,电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析,亲和层析,（一）膜分离,原理 利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的,差别,对于各种薄膜表现出不同的可透性而达到分离的目,的膜分离技术分为反渗透,(,RO),、超滤(,UF),、纳滤,(,NF),、,微滤,(,MF),。

主要区别在于膜孔径的大小酶纯化中常用的,是超滤和微滤,特别是浓缩和脱盐几种膜分离技术特点,1、透析(,dialysis,),原理,P159,1),透析膜 纤维素或其衍生物制成透析袋已经商品化2)透析袋预处理,3)透析方法及装置,2.超滤,原理,P164-165,利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的这种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法超滤膜的截留分子量范围从5000到500000透析方法示意图,超滤工作示意图,（二）凝胶过滤法,(,gel filtration),1、原理,2、,凝胶的种类,1.,交联葡聚糖凝胶结构的示意图,葡聚糖凝胶的种类和规格,3、,凝胶过滤技术,4,、凝胶过滤技术的应用,（三）离子交换层析,(,Ion Exchange Chromatography,IEC,),1、原理,离子交换吸附洗脱示意图,2、离子交换剂,3、离子交换技术：,P182,（四）疏水层析,(,Hydrophobic Chromatography,),1、原理,一些疏水性较强的介质对疏水性较大的蛋白质有较强的,吸附作用，而且吸附后不容易被洗脱下来。

尽管多数蛋白质,都溶于水，具有较强的亲水性，但实际上分子内部都存在着,一个疏水核心中心，分子构象十分复杂分子内部都不同程,度存在着一些疏水基团或疏水中心区如蛋白质表面含有某,些非极性氨基酸侧链，其中包括,Leu、Phe、Trp、Ala、Pro,等,氨基酸，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质疏水核心中,心，决定了蛋白质的疏水性质P188,2、疏水层析介质：,P188,3、疏水层析技术：,P189,（五）吸附层析,(,Absorption Chromatography,),1、原理,液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品（分子。