免疫浊度分析技术.ppt

免疫浊度分析技术n20世纪70年代建立它是将液相内的沉淀试验 与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分 析技术当可溶性抗原与相应的抗体特异结合， 在二者比例合适、并有一定浓度的电解质存在时 ，可以形成不溶性的免疫复合物，使反应液出现 浊度这种浊度可用肉眼或仪器测知，并可通过 浊度推算出复合物的量，即抗原或抗体的量n免疫浊度测定是定量测定微量抗原物质一种高灵 敏度、快速的自动化免疫分析技术,其应用广泛 免疫浊度分析方法类型n一、透射免疫比浊法n二、速率抑制免疫比浊法n三、散射免疫比浊法n四、免疫胶乳浊度测定法一、透射免疫浊度测定法原理：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复 合物，使反应液出现浊度当反应液过量时，形成的 复合物随抗原量的增加而增加，反应液的浊度亦随之 增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物质 的含量 技术要点： 1）抗原参考品及待测标本作适当稀释；2）将待测标 本和标准抗原液（5个浓度）与适当过量的抗血清混 合，在一定条件下，抗原抗体反应完成后，在 340nm处检测各管吸光度；（3）以剂量-反应曲线 求得标本中抗原的浓度方法评价：n本法操作简便，结果准确，能用全自动化 或半自动化仪器进行分析。

n灵敏度低于散射比浊法，但比单扩散法高 5-10倍n抗体用量较大，检测需抗原抗体反应达到 平衡，耗时较长n不宜用于药物半抗原的检测二、散射免疫比浊法 n1967年Ritchie等利用激光照射在液相 中的抗原抗体复合物微粒上时，部分光 线发生散射的原理，通过测量散射光的 强度来得知待测抗原的量，这种比浊测 定法称为散射比浊法n1977年Sternberg进一步发展建立了 速率散射比浊法使微量抗原的定量测定 得以快速灵敏地进行基本原理n散射比浊法是指沿水平轴照射的一定波长的光， 通过溶液时光线被免疫复合物粒子颗粒折射，发 生偏转，产生散射光反应溶液中的悬浮分子， 无论是固体或胶体粒子都可以是散射中心当入 射光通过时，如果颗粒直径比入射光的波长小很 多（入射光波长的1/10～1/20），则散射光 在各个方向上的分布比较均匀，称为Rayleigh 散射；粒径与入射光的比例增大，正向散射光强 度趋于增强，当粒径略小于入射光波长时，称为 Debye散射；如果颗粒直径接近或大于入射光 波长时，则散射光呈明显的不均匀分布，称为 Mile散射n①入射光波长越小，散射光越强；n②散射光强度与粒子的浓度和体积成正比；n③散射光强度随焦点至检测器距离的平方和 而下降。

因此，在散射比浊中，增加抗原抗体复合物 的体积，减少入射光的波长，将检测点尽可 能地接近散射源并选择合适的检测夹角，都 可使检测的灵敏度增加由于散射比浊法测 定的是散射光的信号，避免了透射光中所含 有的透射、散射甚至折射等杂信号成分的影 响，因此，散射比浊法的灵敏性和特异性均 好于透射比浊法散射比浊法类型n终点散射比浊法 n速率散射比浊法 （一）终点散射比浊法n抗原、抗体相遇后免疫沉淀反应立即开始 ，但反应达到平衡通常需10～30min 免疫浊度测定应在复合物聚合产生絮状沉 淀之前进行，否则光散射值降低，影响测 定结果因此，终点散射比浊通常是在免 疫反应进行到一定时间时测量其浊度，故 亦可称为定时散射比浊 （二）速率散射比浊法n速率散射比浊法是一种先进的动力学测定法， 1977年由Sternberg首先用于免疫学测定 n所谓速率是指单位时间内抗原与抗体反应的速 度n抗原与抗体结合形成免疫复合物的速度，在每 个单位时间内是不相同的，在抗体过量的情况 下，随着反应时间的延长，免疫复合物的总量 逐渐增加，通常在25s时出现一个反应最快的 速率峰峰值与抗原量呈正相关抗原抗体反应的速率变化time散 射 光 强 度到达峰值时间三、速率抑制免疫比浊法n本法是一种竞争性结合或竞争性抑制试验 ，主要用于测定半抗原和药物等小分子物 质。

n试剂中的特异性抗体是由半抗原与载体蛋 白偶联后，免疫动物制备而成 n试验时先将一定量的已知半抗原-载体（大 分子）与限量的特异性抗体发生反应，生 成的免疫复合物可形成一定的速率散射峰 值n当反应系统内加入待检标本时，其中所含 的半抗原（小分子）与抗体竞争结合，使 大分子的半抗原-载体-抗体复合物的形成 受到抑制，速率散射峰值降低，其降低程 度与标本中的待测半抗原（或药物）成正 比，根据标准曲线可计算出标本中待测物 质的含量四、免疫胶乳浊度测定法n[原理]：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳 颗粒上，当遇到相应的抗原时，则使乳胶颗 粒发生凝集单个胶乳颗粒在入射光波长之 内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗 粒凝聚时，则使透过光减少，这种减少的程 度与胶乳凝集的程度呈正比，当然也与待测 抗原量呈正比五、免疫浊度分析的影响因素n 抗原抗体反应的比例 n 抗体试剂的质量 n 抗原抗体反应的溶液 n 增浊剂的作用 （一）抗原抗体反应的比例n浊度法中的免疫反应遵循抗原抗体反应的一般规 律免疫浊度测定的反应体系中必须始终保持抗 体过量，以保证免疫复合物的生成量与浊度的改 变一致，这是免疫浊度测定的基本原则。

n抗体过剩必须适量，因此实验中掌握抗体的浓度 是个关键 n为了减少非特异性浊度（“伪浊度”）的出现，还 应对抗原（待测样品）进行适当的稀释二）抗体试剂的质量 n1．抗体的质量：免疫比浊测定法要求抗 体的特异性强，效价高，亲和力强n2．抗体的类型 ：根据抗血清来源的动物 种类不同，抗体可分为R型（rabbit type）和H型（horse type） R型 抗体是用于免疫比浊测定的较为理想的试 剂三）抗原抗体反应的溶液 n反应液对免疫复合物的形成也起重要作 用抗原抗体反应液的最适pH值为6.5 ～8.5，超过此限度则不易形成复合物 ，甚至可引起复合物解离在一定范围 内，离子强度大，复合物形成快；离子 强度过低或无电解质存在，则不易出现 可见的沉淀反应离子的种类也可影响 免疫复合物的形成，一般常使用磷酸盐 缓冲液作为免疫浊度法的反应液 （四）增浊剂的作用 n在反应体系中加入某些非离子型亲水剂， 如聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）、吐温-20（tween- 20）等，可以促进抗原抗体复合物的形 成，增加反应浊度n以PEG6000为最常用 全自动的免疫浊度测定仪特点n①速率散射或透射比浊；n②抗原过剩检测；n③自动控制系统，包括自动稀释加液和标本、 试剂液面感应装置、试剂冷藏和反应控温系统 ；n④自动监测系统，能对试剂、样品和仪器状态 自动监测并及时报警；n⑤数据处理系统，包括数据的计算、患者和测 试资料的储存、实时质控等功能；n⑥校准和定标程序。

六、免疫浊度测定法的应用n免疫浊度法早期主要用于血清、尿和脑 脊液中蛋白质含量的测定n近年来，随着免疫浊度测定仪性能的不 断完善，免疫浊度法的检测范围不断扩 大六、免疫浊度测定法的应用n目前主要应用于血液、体液中的特定蛋白 系列，如免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、κ 、λ，补体C3、C4，血浆蛋白AAT、TRF、 A1M、CER、HPT、PAB、ALB，炎性反应蛋 白SAA、CRP、载脂蛋白APO、ABI、RF、 ASO尿微量蛋白系列和一些小分子量的治 疗性药物浓度等的检测。