刺玫果中花色苷提取工艺优化及抗氧化性分析.docx

    刺玫果中花色苷提取工艺优化及抗氧化性分析    周新宇，吕重宁，秦汝兰, （1.通化师范学院医药学院，吉林通化 134000；2.沈阳药科大学中药学院，辽宁沈阳 110016）刺玫果（Rosa davuricaPall.）为蔷薇科蔷薇属植物刺玫的成熟果实，又名蔷薇果、山刺玫果、野刺玫果等野生资源丰富，主要分布于我国东北、内蒙、山西及河北等省区刺玫果中含有黄酮、维生素、皂苷、多糖、三萜类等多种活性物质，其中研究较多的为黄酮类化合物[1]，但关于刺玫果中花色苷的研究报道较少刺玫果果实酸甜可口，营养丰富据《中国中药大辞典》中记载，刺玫果可用于治疗胃腹胀痛、小儿积食、咳嗽、腹泻及维生素C缺乏症等疾病，并具有明显的抗疲劳、耐缺氧、抗炎及增强免疫等活性[2-3]目前，以野生刺玫果为主要原料的食品、保健品和功能性饮料不断出现[4]花色苷（anthocyanins）是具有2-苯基苯并毗喃结构的一类糖苷衍生物，其共轭双键在465～560 nm处有最大光吸收，为植物界中广泛分布的一种水溶性色素，普遍存在于植物的花、果实、根、茎、叶中，具有抗氧化、保护心血管、抗肿瘤等多种功能[5-6]近年来对于花色苷抗氧化作用的研究较多，如吴映梅等[7]通过体外抗氧化实验得出黑莓中的总花色苷对DPPH自由基和羟自由基具有较强的清除作用。

闫亚美等[8]研究发现质量浓度为0.1 mg·mL-1黑加仑花色苷提取液较同质量浓度的抗坏血酸，表现出更强的还原能力和自由基清除能力何传波等[9]研究紫薯中花色苷抗氧化活性得出总抗氧化能力为101.38 U·mg-1，表明其花色苷抗氧化活性较强综合文献分析，进一步揭示花色苷为最直接有效、安全的自由基清除剂[10]此外，随着研究水平的不断提高，人们逐渐发现合成色素对人体健康存在一定的危害，因而从天然植物中寻找花色苷作为食品着色剂引起了人们的广泛关注[11]本研究以花色苷得率为评价指标，采用Plackett-Burman设计并结合Box-Behnken实验确定刺玫果中花色苷的最佳提取工艺，通过多种体外抗氧化方法评价刺玫果中花色苷的抗氧化活性，为刺玫果资源的开发及后续产品的研制提供理论依据1 材料与方法1.1 材料与仪器刺玫果样品 采于通化师范学院周边经通化师范学院于俊林教授鉴定为刺玫果（Rosa davuricaPall.）正品，烘干粉碎后备用；无水乙醇、丙酮、甲醇、盐酸等试剂 均为国产分析纯；DPPH（1，1－二苯基-2-三硝基苯肼）、ABTS（2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 阿拉丁试剂，上海有限公司。

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1.2.4 单因素实验1.2.4.1 料液比考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，料液比分别按照1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g·mL-1，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次1.2.4.2 溶剂pH考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，溶剂pH分别为1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次1.2.4.3 超声温度考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，超声温度分别为20、30、40、50、60 ℃，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次1.2.4.4 乙醇体积分数考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，乙醇体积分数分别为20%、40%、60%、80%、100%，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次1.2.4.5 超声时间考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，超声时间分别为10、20、30、40、50 min，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次。

1.2.4.6 超声次数考察 称取刺玫果粉末1 g，5份，超声次数分别为1、2、3、4、5，其余因素按“1.2.2”项下方法制备得到样品溶液并于532 nm波长处测定吸光度值，每组实验平行3次1.2.5 Plackett-Burman试验设计 通过Plackett-Burman试验对可能影响刺玫果花色苷的6个因素，包括溶剂pH、超声时间、乙醇体积分数、超声温度、料液比、超声次数进行主效应分析，选用n=12的Plackett-Burman因素筛选试验，6个因素分别对应表中的6个列，每个因素取低水平“-1”和高水平“1”，以样品溶液的吸光度值A为响应值对实验结果进行分析，得出各因素的F值和P值，选取影响结果的关键因素，Plackett-Burman实验因素水平表和编码见表1表1 Plackett-Burman实验因素水平和编码Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental1.2.6 Box-Behnken实验设计 在Plackett-Burman实验基础上，选取超声时间（A）、乙醇体积分数（B）、超声温度（C）、料液比（D）四个因素，以刺玫果花色苷吸光度值（Y）为响应值，通过四因素三水平实验进行响应面分析，实验设计因素水平见表2。

表2 Box-Behnken实验因素与水平设计Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiment1.2.7 验证性实验 为确定响应面回归模型的建立的准确性，对模型预测的最优工艺条件进行适当调整后进行验证，实验平行操作3次通过pH示差法[13-14]，按照下列公式计算刺玫果中花色苷含量式中：X为刺玫果花色苷含量（mg·g-1）；ΔT为吸光度ApH1和ApH4.5的差值；V为稀释体积（L）；F为稀释倍数；M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量（449 g·mol-1）；ε为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数[26900 L·（mol·cm）-1]；m为样品质量（g）；b为比色皿厚度（1 cm）1.2.8 刺玫果中花色苷体外抗氧化活性研究1.2.8.1 待测溶液的配制 按“1.2.7”项下最佳工艺条件提取刺玫果花色苷，减压浓缩至稠膏状，临用前稀释制成所需质量浓度1.2.8.2 刺玫果中花色苷对DPPH·清除率测定 精确称取15.7685 mg的DPPH粉末，置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容至刻度，制成浓度为0.4 mmol·L-1的DPPH溶液，避光保存。

按照“1.2.8.1”项下方法，制成1、2、3、4、5 mg·mL-1浓度供试品溶液试验分为样品组、对照组和空白组，并于517 nm波长处测定各组吸光度值，其中空白组和样品组加入DPPH乙醇溶液后需避光静置1 h，其它操作相同以VC溶液作为参照，按下列公式计算刺玫果中花色苷对DPPH·清除率[15-16]式中：A空白为2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL蒸馏水的吸光度值；A对照为2 mL蒸馏水+2 mL样品溶液的吸光度值；A样品为2 mL DPPH乙醇溶液+2 mL样品溶液的吸光度值1.2.8.4 刺玫果中花色苷对ABTS+·的清除能力的测定 分别取7 mmol·L-1ABTS水溶液和2.5 mmol·L-1过硫酸钾水溶液5 mL，混匀，置于暗处反应12～16 h，使其产生ABTS+·，用蒸馏水将ABTS+·溶液稀释，使其在734 nm波长下的吸光值为0.70±0.02，得到工作液按照“1.2.8.1”项下方法，制备2、4、6、8、10 mg·mL-1浓度供试品溶液吸取1 mL系列浓度刺玫果花色苷溶液置于具塞试管中，分别加2 mL ABTS+·溶液，混合均匀，10 min后测定734 nm处的吸光值记作A1；吸取2 mL ABTS+·溶液与1 mL蒸馏水，混合10 min后测定734 nm处的吸光值记作A0；吸取2 mL磷酸盐缓冲液与1 mL系列浓度刺玫果花色苷溶液，混合10 min后测定734 nm处的吸光值记作A2。

以VC作为阳性对照，操作方法同上按下列公式计算刺玫果中花色苷对ABTS+·清除率[19]1.3数据处理采用SPSS19.0统计软件进行单因素试验中Duncan’s多重差异显著性分析并计算样品对各自由基清除能力为50%时的IC50实验数据图采用Excel 2010进行绘制2 结果与分析2.1 刺玫果中花色苷最大吸收波长的确定由图1可知，刺玫果花色苷提取液在532 nm处具有吸收峰因此确定刺玫果花色苷最大吸收波长为532 nm图1 刺玫果花色苷在200～700 nm波长下的吸光度值Fig.1 Absorbance of anthocyanins of Rosa davurica Pall. at 200～700 nm2.2 提取溶剂的确定由于花色苷是极性分子，因此常用乙醇、甲醇或丙酮做为提取溶剂[20]，Bridgers等以甲醇、乙醇、酸化甲醇和酸化乙醇从紫红薯中提取花色苷时发现，酸化甲醇的提取效果最好[12]Awika等用丙酮和酸化甲醇提取黑高粱花色苷时发现酸化甲醇的提取效果优于丙酮，经过液相分析得出丙酮提取的花色苷分子结构被修饰[21]由图2可知，4种提取溶剂从刺玫果中提取花色苷后测定的吸光度值基本与文献得出的结论一致，分别为甲醇＞乙醇＞水＞丙酮，尽管很多报道表明甲醇的提取效果最好，但甲醇具有一定的毒性，因此选择乙醇为提取溶剂。

并且花色苷在中性或碱性条件下不稳定，通常采用酸化的有机溶剂进行提取图2 提取溶剂对花色苷提取效果的影响Fig.2 Effects of extraction solution on anthocyanins extraction2.3 单因素实验结果2.3.1 料液比对刺玫果花色苷提取效果分析 由图3可知，随着料液比的增大，刺玫果中花色苷的吸光度值呈现递增的趋势，当料液比超过1:15时，刺玫果花色苷的提取量呈现递减趋势一定质量的刺玫果中花色苷提取率是有限的，溶剂体积的增大利于有效成分的溶出，当提取剂用量继续增加时，反而花色苷得率略有降低，表明花色苷已基本从组织中充分溶出，且提取剂过剩，不但会影响超声效果，而且可能会导致花色苷的水解，适当的料液比不仅有利于花色苷的溶出，而且也减少了料溶剂过多造成的试剂浪费[22]，故选择料液比为1:15进行提取图3 料液比对花。