酪蛋白的提取与测定.doc

牛乳中酪蛋白的制备与浓度测定一、实验目的1、学习从牛乳中分离酪蛋白的原理和方法2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法3、了解紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理，熟悉紫外分光光度计的使用4、学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度二、实验原理1、准备酪蛋白原理：牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白两种蛋白质，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%牛乳在PH4.7时酪蛋白等电聚沉后剩余的蛋白质统称为乳清蛋白酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液乳清蛋白不同于酪蛋白，其粒子的水和能力很强，分散性高，在乳中呈高分子状态本法利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的PH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白2、紫外吸收法测定蛋白质浓度的原理：大多数蛋白质由于有酷氨酸和色氨酸的存在，在紫外光280nm有吸收高峰，可以进行蛋白质含量的测定但是核酸在280nm也有吸收，干扰测定，不过核酸的最大吸收峰在260nm，通过测定在280nm和260nm时A的比值，然后通过计算消除核酸存在的影响，可以求得有核酸存在时蛋白质的浓度3、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度原理：考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定三、实验器材与试剂1、制备酪蛋白：烧杯、玻璃棒、量筒、精密PH试纸、离心机、布氏漏斗、表面皿、恒温水浴锅牛奶、醋酸缓冲液、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醚2、紫外光吸收法：紫外可见光分光光度计、容量瓶50ml(×1)、石英比色皿0.9%NaCl、1mol/LNaOH溶液、1mol/L乙酸溶液3、考马斯亮蓝法：紫外可见光分光光度计、试管1.5cm×15cm(×9)、玻璃比色皿牛血清白蛋白（0.1mg/ml）、考马斯亮蓝、0.9%NaCl四、实验步骤制备酪蛋白1、将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40℃2、将20mL牛奶加热至40℃，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3、用精密pH试纸调pH至4.7，可见溶液变为乳白色悬浮液4、待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心5min，弃上清，得酪蛋白粗制品5、用蒸馏水洗沉淀3次，3000rpm离心5min，弃上清6、在沉淀中加入20mL95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤7、用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀2次（10ml/次），最后用乙醚洗涤沉淀2次（10ml/次），抽干8、将沉淀摊开在表面皿上，风干，得酪蛋白纯品9、准确称量，计算含量和得率紫外光吸收法1．取待测样品溶液置于的石英比色皿中，于分光光度计波长280nm和260nm，分别读取A280nm和A260nm，用生理盐水为比色空白对照。

2．若A280nm/A260nm>1.5，用公式：蛋白质含量（mg/ml）=A280nm/6.3*10若A280nm/A260nm<1.5，用公式：蛋白质含量（mg/ml）=1.45A280nm—0.74A260nm考马斯亮蓝法取9支干净试管，按表进行编号并加入试剂混匀，室温静置3min，以第1管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（μg/ml）作为横坐标作图得标准曲线五、实验数据酪蛋白质量：0.5421g酪蛋白含量：2.71g/100ml牛乳紫外光吸收法：A280nm 0.769A A260nm 0.959AA280nm/A260nm<1.5，蛋白质含量（mg/ml）=1.45A280nm—0.74A260nm =0.405 mg/ml考马斯亮蓝法管号1（空白）23456789标准蛋白液/ml00.10.20.30.40.60.8——样品/ml———————110.9%NaCl/ml10.90.80.70.60.40.200考马斯亮蓝染液/ml4.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度/（μg/ml）0102030406080　　A595nm00.1400.2880.430.5760.6550.9720.1780.262蛋白质浓度为。