无菌检查法试验具体操作方法 课件.ppt

LOGO无菌试验具体 操作方法实际应用及注意事项分类具体检测方法讨论概述试验物品准备无菌操作的要求及注意事项一、概述v无菌检查法系用于确定要求无菌的生物制品、原料 、辅料及要求无菌的其他品种是否无菌的一种办法 v若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在 该检验条件下未发现微生物污染 v无菌检查在生产检定中是很重要的一个检项，如果 出现差错会有很大的隐患，近年注册申报资料中无 菌检查法验证的内容确实在日渐完整和规范 v2005年版《中国药典》无菌检查法增加了方法验证 的内容，增加了试验的可操作性，方法更具有科学 性，提高检出率保证检验结果的准确性二、试验物品准备v1、培养基数量及选用：首先要确认本次试验供试品所需培养基的数量在此基础，要多加一套相同的培养基做阴性对照 v 合格的培养基应保存在2-25℃并防止被污染, v 使用期限不得超过3周.无菌试验对培养基的质量要求高，应选用完全透明 无沉淀的培养基，确认检查合格后放入试管架中，置 操作间，方可使用二、试验物品准备v在选取培养基时，放于眼 前细致观察（包括PH值，装 量是否一致、试管有无裂痕 ）v因培养基在搬运过程中， 容易造成个别试管胶栓松动 ，从而影响PH值的细微变化 。

v如不细致察看，在试验中 会存有很大的隐患，影响结 果的判定二、试验物品准备：v2、灭菌物品的确认：高压根据试验要求，准备所需器材和物品需在灭 菌物品盒标注名称，并填写灭菌日期，清点无误后 将其送至灭菌前间灭菌是无菌物品生产的重要环节，根据物品的性能 选择合适的灭菌方式，是确保试验质量的关键我们通常把玻璃器皿包括吸管瓶子选择180℃2小时 干热灭菌，胶栓121℃60分钟灭菌，取回灭菌物品 时，一定要在有效期内使用，试验前确认指示剂是 否合格及包装的完整性，干燥性，合格后方可使用 二、试验物品准备：v物品摆放整齐的准备间：二、试验物品准备：v工作人员在控制高压温度：三、无菌操作要求及注意事项环境操作人员三大要素三大要素三、无菌操作要求及注意事项vv环境环境： 1.无菌操作应在环境洁净度 10000级和局部洁净度100级 的单向流空气区域内或隔离 系统中进行，其全过程必须 严格遵守无菌操作，防止微 生物污染 2.工作台面及操作室环境应 定期按《医药工业洁净室（ 区）悬浮粒子、浮游菌和沉 降菌的测试方法》的进行洁 净度验证三、无菌操作要求及注意事项3.无菌操作室每天都要用0.1%的新洁尔灭或来苏水 清洁剂，清洁―次(抹布要专用).紫外线照射消毒 30-50min；超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。

然 后紫外线消毒30min在工作台面消毒时切勿将供 试品和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面 上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡紫外线， 降低消毒效果三、无菌操作要求及注意事项vv人员人员：无菌试验操作进入 万级操作间时，操作 人员必须着装整齐， 穿好已灭菌的三更服 装需带两层口罩，一 层是白纱布，最后一 层随三更服已灭菌的 口罩方可进入无菌室进 行操作 三、无菌操作要求及注意事项vv操作操作即便使用设备完善的实验室即便使用设备完善的实验室 技术操作不规范技术操作不规范, ,也会导致污染也会导致污染.三、无菌操作要求及注意事项在操作中为最大可能的保证无菌每一项工作都必须做到有条不紊 三、无菌操作要求及注意事项vv操作操作 1.在开试验前要制定好实验计划和操作程序有关数据的计算要事先做好准备各种所需器材和物品、清点无误后将其 放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开 始消毒这可以避免开始实验后，因物品不全，往返 拿取而增加污染机会三、无菌操作要求及注意事项2.在无菌环境进行试验时，操作人员要确定好自 己所工作的位置，操作前戴手套，酒精棉进行消 毒3.点燃煤气灯后用火焰先把试管架上的培养基 胶栓与试管口处烧灼一下，以后一切操作，如打 开或封闭瓶口时，都需在火焰近处并经过烧灼进 行。

但要注意：金属器械不能在火焰中烧的时间过长 ，烧过的金属镊要待冷却后方可使用三、无菌操作要求及注意事项4.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残 留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会 把有害物带入培养基中开启、关闭供试品时，火焰灭菌时间要短，防止 因温度过高灭活供试品另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生 有毒气体，危害供试品 5.进行试验时，吸管抽取供试品后，要与培养基试 管平行且垂直，动作要准确敏捷，但又不必太快 ，以防空气流动，增加污染机会三、无菌操作要求及注意事项6.吸取营养液、 氯化钠等及各种用液时，均应分别 使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致交叉 污染手或拿取物品时不能经过打开的瓶口上方 ，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管废弃 7.不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰 烧灼消毒或取备品更换工作由始至终要保持一 定顺序性供试品在未使用之前，用煤气灯先把 试管架上的培养基胶栓及试管口处烧灼一下，勿 过早暴露在空气中同样，培养基在未用前，不 要过早开栓 用过之后如不再重复使用，应立即封 闭瓶口，直立可增加落菌机会四、具体检测方法检测方法检测方法支原体检测支原体检测无菌试验无菌试验四、具体检测方法硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 用于培养用于培养需氧菌需氧菌/ /厌氧菌厌氧菌改良马丁培养基改良马丁培养基 用于培养用于培养真菌真菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基 用于培养用于培养需氧菌需氧菌无菌试验培养基无菌试验培养基 四、具体检测方法v无菌试验样品取样标准： v1.原液及半成品：抽检量应至少为0.1%，但不得少于10ml，如原液 及半成品除菌过滤后，分别于多个容器内，则每个容 器抽检量不得少于10ml，原液及半成品每开瓶一次， 应如上法抽检。

四、具体检测方法v无菌试验样品取样标准： v2.成品：每亚批均应进行无菌检查，供试品应随时抽取， 包括分装过程中的前、中、后抽样①分装量在100支（瓶）或100支（瓶）以下者抽验量 不少于5支②101-500支（瓶）者抽验量不少于10支（瓶）③500支（瓶）以上者抽验量不少于20支（瓶）四、具体检测方法123无菌试验检测方法直接法直接法增菌法增菌法薄膜过滤法薄膜过滤法 四、具体检测方法v增菌法：含防腐剂的供试品，应先增菌培养. v按种量与培养基的比例：用苯酚或三氯甲烷作防腐剂者至少为1:20，用汞作防腐剂者或制品内含有甲醛，抗生素者至少 为1:50. v将混合供试品先按此比例接种于硫乙醇酸盐流体培 养基（不得少于200ml）内增菌，于20-25℃培养3 天后移种至硫乙醇酸盐流体培养基，营养琼脂斜面 ，改良马丁培养基各2管，每管10ml，培养基接种 0.5ml四、具体检测方法v直接法:不含防腐剂供试品，不需增菌培养. v按成品抽样量及抽验瓶数的要求将每批（或亚批） 抽检的供试品逐瓶（支）取样混合:装量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶（安装）混合， 装量在5.0ml以上者，每7瓶（安装）混合， v应接种培养基管数依供试品混合总量而定。

v混合后的供试品接种量按不超过培养基体积10%（ ml/ml）直接接种于硫乙醇盐酸流体培养基，营养 琼脂斜面及改良马丁培养基，三种培养基接种支数 之比为1：1：1四、具体检测方法v薄膜过滤法: v采用全封闭式薄膜过滤器，薄膜孔径不大于0.45um， 膜直径约47mm. v取规定抽验供试品数，（如供试品少于10ml，则先加 入100ml0.9%,无菌氯化钠溶液或适宜的无菌溶剂）， 立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内，加压或减 压过滤 v含汞类等防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9% 无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次 ，每次100ml，过滤后，两个滤器中加硫乙醇盐流体 培养基各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml 四、具体检测方法增菌法、直接法增菌法、直接法 薄膜过滤法薄膜过滤法30-3530-35℃℃20-2520-25℃℃30-3530-35℃℃20-2520-25℃℃硫乙醇酸盐硫乙醇酸盐 培养基培养基1 11 11 11 1营养琼脂营养琼脂 培养基培养基 1 11 1--------------------------------改良马丁改良马丁 培养基培养基0 02 2OO2 2无菌试验的培养基加入样品后，全部采取静止培养，整无菌试验的培养基加入样品后，全部采取静止培养，整 个培养过程不许摇晃。

同时以个培养过程不许摇晃同时以0.9%0.9%的无菌氯化钠溶液代替的无菌氯化钠溶液代替 供式品供式品, ,同法操作做阴性对照同法操作做阴性对照. .培养时间不得少于培养时间不得少于1414天四、具体检测方法无菌试验结果判定：对每一试管逐一进行验证，PH是否有变化有无菌落 生长，应完全透明无沉淀 v1.硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基均为澄 清，营养琼脂斜面未见菌生长，判供式品符合规定 v2.如硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、营 养琼脂斜面中任何一管有菌生长，并证明生长的微 生物为供试品含有，判定供式品不符合规定四、具体检测方法当满足下列至少一个条件时，判实验结果无效： v对无菌检查相关设施的微生物监控数据表明其不符合 其规定； v对无菌检查过程的回顾，揭示了本操作程序是错误的 ； v阴性对照管有菌生长； v供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证微生物生长 是因无菌检查中使用的物品和无菌操作技术不当引起 的；四、具体检测方法供试品复检v 无菌试验如经确认无效，应重试重试时，重新取同量供试品，依法重试，如无菌生长，判供试品符合规定 ，如有菌生长，判供试品不符合规定四、具体检测方法v支原体：vv支原体是一种大小介于细菌和病毒之间支原体是一种大小介于细菌和病毒之间( (最小直径最小直径0 0 ．．2um)2um)并独立生活的微生物并独立生活的微生物 . .vv多数支原体适合于偏碱条件下生存多数支原体适合于偏碱条件下生存(PH7(PH7．．6-86-8．．0)0)，， 对酸耐受性差。

对酸耐受性差vv对热比较敏感，对一般抗生素不敏感对热比较敏感，对一般抗生素不敏感vv通常，通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的滤过除菌的方法对支原体是没有作用的四、具体检测方法v细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是 个世界性问题v在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，国 内外研究表明，大约有二十多种支原体能污染 细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支 原体四、具体检测方法9595％以上％以上 是以下四种支原体是以下四种支原体口腔支原体精氨酸支原体猪鼻支原体 莱氏无胆甾原体 为牛源性四、具体检测方法v支原体检测：v支原体因病毒类疫苗类中所用的牛血清可能 被感染支原体，所以生产所收获病毒收获液 都要做支原体检测 v使用培养基为流体和半流体培养基四、具体检测方法工作环境的污染 被污染细胞造成 的交叉污染 操作者本身的污染 某些支原体在人体 是正常菌群 制备细胞的原始组织 或器官的污染培养基的污染 实验器材的污 染支原体 污染源四、具体检测方法v图为GHK细胞当支原体污染后，因为它们不 会使细胞死亡可以与细胞长期 共存，培养基一般不发生浑浊 ，细胞无明显变化，外观上给 人以正常感觉。

实则细胞受到多方面潜在影响 ，如引起细胞变形，抑制细胞 生长等 最为致命的是，即使存在很严 重的支原体污染，细胞外观可 无明显变化如果继续使用这 种已被支原体污染，而貌似正 常的细胞做实验，将会严重影 响实验结果四、具体检测方法v支原体检测步骤： v供试品如在分装后，24小时以内进行支原体检查 可储存于2-8℃，超过24小时应置-20℃以下储存 v支原体半流体培养基使用前煮沸10-15分钟，冷却 至56℃左右备用 v支原体半流体培养基与支原体肉汤培养基加入灭 能小牛血清（培养基：血清为8：2）四、具体检测方法支原体半流体培养基（4支）支原体肉汤培养基（4支）第7天。