红细胞膜蛋白提取流程ppt课件.ppt

红细胞膜蛋白提取鉴定红细胞膜蛋白提取鉴定内容内容 1. 红细胞膜提取胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量膜蛋白提取及定量测定〔定〔Lowry法〕法〕 3.膜蛋白膜蛋白电泳分泳分别、分子量、分子量测定定 SDS-PAGE 4.western blotting 鉴定定β-actin 实验报告要求：实验报告要求： 分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论 手写，手写，A4 纸大小纸大小 ，报告首页写明，报告首页写明 实验者，专业实验者，专业实验分组每个班分三大组，每组十人左右，选出组长每个班分三大组，每组十人左右，选出组长实验进展一大组为单位实验进展一大组为单位 1. 1.纯化纯化RBCRBC膜膜 2.SDS-PAGE 2 2.SDS-PAGE 2块胶〔一个凝胶架〕块胶〔一个凝胶架〕 3.western blot 3.western blot 4.3-4 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量人一小组测定蛋白质含量 一一.红细胞膜提取制备〔低渗法〕红细胞膜提取制备〔低渗法〕原理：原理： RBC置低渗置低渗缓冲液冲液(pH7.4)，破裂溶血，破裂溶血 －－溶血液。

－－溶血液 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和和其它内含物，制得其它内含物，制得纯真的真的RBC膜－－称膜－－称为血影血影 “ghost〞〞本卷须知：本卷须知：1.1.离心步离心步骤一定要一定要““平衡、平衡、对称放置〞称放置〞2.2.溶血液离心后上清汲取小心，以免溶血液离心后上清汲取小心，以免丧失失““膜膜〞〞3. 3. 缓冲液冲液pH7.4pH7.4，偏酸使，偏酸使HbHb残留添加残留添加4.4.此分此分别方法适宜于人、大鼠；牛、猪等易使方法适宜于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白零落，脂蛋白零落，1mMCaCl21mMCaCl2可防止此种膜的不可防止此种膜的不稳定性5.5.本本实验因条件限制，在常温离心如需因条件限制，在常温离心如需坚持持蛋白活性，蛋白活性，应在在4 4˚C C离心〔〔1〕〕RBC分分别：： 15 ml RBC液液 2000rpm 5分分钟 RBC〔沉淀〕＋〔沉淀〕＋3倍体倍体积等渗磷酸等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分分钟×2 洗洗净之之RBC 〔〔2〕溶血液制〕溶血液制备 RBC参与低渗磷酸参与低渗磷酸buffer〔〔>1:50) (在在 烧杯中〕杯中〕 稍稍搅拌拌 置冰箱置冰箱冻格〔格〔4˚C〕溶血〕溶血过夜夜 〔以上步〔以上步骤已完成！！〕已完成！！〕溶血液，用溶血液，用“水水泵〞吸去上清。

〞吸去上清 ！！：膜很！！：膜很轻二、二、 RBC膜纯化〔洗涤〕膜纯化〔洗涤〕 RBC膜膜转至至 1.5ml塑料管〔塑料管〔2个个/大大组〕〕 9000rpm 5’ 沉淀〔膜〕＋低渗磷酸沉淀〔膜〕＋低渗磷酸Buffer〔〔pH7.4) ?ml 〔吹打〕〔吹打〕 9000rpm 5’×4 沉淀沉淀 ＋等渗磷酸＋等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分分钟 沉淀〔沉淀〔RBC膜〕＋膜〕＋0.6ml等渗等渗Buffer 〔即〔即为RBC原液〕原液〕三、三、 样品品处置：置： 1.SDS-PAGE用用样品品处置〔一大置〔一大组〕：〕： 0.3ml RBC原液原液+0.3ml 样品溶解液品溶解液 沸水浴沸水浴 5’ 2.Lowry法法测定用定用样品品处置置 (3-4 人人/group〕：〕： A. 取取0.3ml RBC原液＋原液＋ 1.5ml H2O＋＋ 150ul NaOH 沸水浴沸水浴 5’ 待待测管管1：： 取取A液液0.1ml＋＋0.9ml H2O 待待测管管2：： 取取A液液0.3ml＋＋0.7ml H2O四、四、Lowry法测定膜蛋白含量法测定膜蛋白含量立刻摇匀，放置立刻摇匀，放置15分钟。

以第６管为空白管，在分光光度计上以分钟以第６管为空白管，在分光光度计上以620ｎｍ比色，读取Ａｎｍ比色，读取Ａ以各管规范蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出规范曲线以各管规范蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出规范曲线2.红细胞膜样品蛋白含量的测定红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管将待测管1、、2同上参与碱性铜及酚试剂，一同测定同上参与碱性铜及酚试剂，一同测定 　　　　管号　　管号试剂试剂１１２２３３４４５５６６H2O (ml) 0.90.80.60.40.21.0标准蛋白标准蛋白0.10.20.40.60.8__碱性铜试剂碱性铜试剂１１１１１１１１１１１１　　　　　　　　　摇匀，放置１０分钟　　　　　　　　　摇匀，放置１０分钟酚试剂酚试剂３３３３３３３３３３３３含标准蛋白含标准蛋白ug255010015020001.1.规范曲线制备规范曲线制备作图：作图： 横坐标以规范蛋白含量横坐标以规范蛋白含量 纵坐标以纵坐标以A620吸光度值吸光度值 图比例应为图比例应为3:2〔横：纵〕〔横：纵〕计算：计算： 在规范曲线上查出待测样品的浓度，计在规范曲线上查出待测样品的浓度，计算算 提取膜的提取膜的 Pr mg数数/ml样品样品 留意稀释倍数留意稀释倍数要求：计算原提取要求：计算原提取RBC液的液的Pr含量含量五、五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量测定膜蛋白分子量 不延续电泳系统： 电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同〔浓缩效应〕 〔一〕垂直板安装〔一〕垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐，每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！夹好，放在胶架上！ 〔二〕凝胶制备〔见表〕〔二〕凝胶制备〔见表〕 先配好分别胶〔留距齿先配好分别胶〔留距齿梳梳1cm〕，待其凝固后，〕，待其凝固后，再配浓缩胶。

再配浓缩胶 〔三〕电泳安装安装〔三〕电泳安装安装 先装内槽，试无渗漏；先装内槽，试无渗漏； 放入外槽中，加放入外槽中，加Buffer 上样品：上样品： 每孔每孔18ul，，2块块/组组 每块板留一规范蛋白孔每块板留一规范蛋白孔〔四〕〔四〕 电泳：电泳： 100V进分别胶调至进分别胶调至80V 约约1.5小时小时 10％分离胶％分离胶 10 ml5％浓缩胶％浓缩胶 5ml30％凝胶储备液％凝胶储备液3.31.0蒸馏水蒸馏水4.04.01.5mol/L Tris-HCl Buffer2.51mol/L Tris-HCl Buffer1.010％％SDS0.10.0810％％ 过硫酸铵过硫酸铵0.06（（60ul)0.06(60ul)TEMED8ul8ul参与过硫酸铵，参与过硫酸铵，TEMED即刻灌胶即刻灌胶〔五〕取胶〔五〕取胶: : 用公用板平面悄然用公用板平面悄然““橇〞开板，推入小平皿中橇〞开板，推入小平皿中 留意：留意： 一一块半干半干转移〔浸入移〔浸入转移移Buffer20minBuffer20min〕〕 另一另一块考考马斯亮斯亮蓝染色染色 染色染色2 2小小时后，后，7%7%醋酸脱色〔醋酸脱色〔×4×4〕〕 每每组做好做好标志〔写好名字〕，交生化室志〔写好名字〕，交生化室扫描或描或摄像像保管。

保管分子量计算分子量计算1.丈量：丈量： cm a.每条每条带间隔隔 〔起始点至〔起始点至带中心〕中心〕 b.起始至示踪染料起始至示踪染料间隔隔2. MR：： 条条带间隔隔(a) MR= 起始至示踪染料起始至示踪染料间隔隔 (b)ab1410062403024分子量分子量KD迁移距离迁移距离cmMR705540352515预染规范蛋白3.半对数图：〔六条规范蛋白〕半对数图：〔六条规范蛋白〕〔参照统计学散点法〕〔参照统计学散点法〕 横坐标为迁移率横坐标为迁移率MR 纵坐标为纵坐标为LogM〔直接按每一蛋白分子量标在半对数图中〕〔直接按每一蛋白分子量标在半对数图中〕4.计算待测样品蛋白质分子量：计算待测样品蛋白质分子量： 选在规范蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三选在规范蛋白迁移范围内的相应待测样品中的三条带，丈量间隔计算条带，丈量间隔计算MR，，Mw 9876543210.1 0.2 0.3 0.4….横坐标为迁移率横坐标为迁移率MR；〔六条规范蛋白〕；〔六条规范蛋白〕纵坐标为纵坐标为LogM〔直接按每一规范蛋白分子量〕〔直接按每一规范蛋白分子量〕2060100六、六、western blotting(β-actin鉴定定)1.转膜膜 将与凝胶将与凝胶块(切去多余部分切去多余部分)普通大小的普通大小的NC膜、膜、滤纸均浸入均浸入转移移Buffer中中20分分钟，取出，在半干，取出，在半干转移槽中按以下移槽中按以下顺序放序放置：置： (上〕阴极端上〕阴极端 滤纸-凝胶凝胶-膜膜-滤纸 阳极端阳极端〔下〕〔下〕 用玻棒用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。

去除空气气泡，盖好上盖 开启开启电源，源，调电压时间20 v，， 20分分钟2.封封锁 将膜取出将膜取出TBST中洗中洗5’，放置于封，放置于封锁液中液中10分分钟，用，用TBST洗洗5’×3；；3.一抗孵育一抗孵育 将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小小时，用，用TBST洗洗5分分钟×3；；4.二抗孵育二抗孵育 将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小小时，用，用TBST洗洗5分分钟×3；；5.DAB显色色 配制配制DAB显色液色液 1 ml〔适量〕，取出膜放入〔适量〕，取出膜放入DAB溶液中，溶液中，显色〔色〔约10分分钟内〕；内〕； 〔〔试剂盒：蒸盒：蒸馏水水1ml ，，A、、B、、C各各一滴放入水中〕一滴放入水中〕 6.结果果扫描保管描保管 银银 染染考马斯亮蓝染色。