GDNF基因修饰的神经干细胞移植对大鼠局灶性脑缺血后GFAP表达的影响.pdf

四川医学2 0 1 3 年8月第3 4 卷( 第 8 期) S i c h u a n M e d i c a l J o u r n a l ， 2 0 1 3 ， V o 1 ． 3 4 ， N o ． 8 ·1 0 9 9· ●基础与实验研究● GD NF基 因修饰的神经干细胞移植对大 鼠局灶性 脑缺血后 GF AP表达 的影响 庞 源广 ， 高， J 、 青 ， 陈 波 ， 杨朝鲜 ， 袁淼 ， 袁琼兰 ( 1 ’． 内江市第一人民医院神经外科， 四川 内江6 4 1 0 o 0 ； 2 ． 泸州医学院神经生物学研究室， 四川 泸州 6 4 6 0 0 o ； 3 ． 同济大学医学院解剖与神经生物学教研室， 上海 2 0 0 0 9 2 ) 论著 【 摘要】 目的探讨胶质源性神经营养因子( g l i a l c e l l l i n e ． d e ri v e d n e u r a l f a c t o r ， G D N F ) 基因修饰的神经干细胞( n e u ． r a l s t e m c e l l s ， N S C s ) 移植对大鼠脑缺血后( g l i al fi b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n ， G F A P ) 的表达的影响。

方法建立大鼠暂时性大脑 中动脉梗塞模型( m i d d l e c e r e b r a l a r t e r y o c c l u s i o n ，M C A O) ， 再灌注3 d ， 并将其随机分为： 生理盐水移植组( N S ) 、 神经干细 胞移植组( N S C s ) 和 G D N F基因修饰的神经干细胞移植组( G D N F ／ N S C s ) 采用脑立体定位仪将移植入大鼠的右侧脑室 再灌注 1 ⋯ 2 3 5 、 7周的各时间点， 处死大鼠， 取同侧大脑半球， 用 We s t e r n b l o t t i n g 观察 G F A P的表达结果G D N F ／ N S C s 组、 N S C s 组和 N S组 G F A P蛋白均在 2周达到高峰 ， 后逐渐降低而再灌注 1～ 7周， G D N F ／ N S C s 组的 G F A P蛋 白显著高 于N S组( P7分) 的为有效模型选人实验 2 j 1 ． 6 动 物 分组 及 移植 ： 将具 有 神 经 功能 缺 失症 状 ( N S S >17分 ) 的大 鼠随机分为 三组 ： 生理盐水移植组 ( N s组) 、 神经干细胞移植组 ( N S C s 组 ) 、 转染 G D N F基 因的神经干细胞移植组( G D N F ／ N S C s 组 ) 各 1 5只。

再 灌注 3 d ， 利用大鼠脑立体定位仪进行脑 内移植 ， N S组 移植生理盐水 2 0 1x l ／ 只， N S C s 组和 G D N F ／ N S C s组移 植细胞悬液 2 0 只， 含细胞 ( 4～5 )×1 0 个 ， 移植速 度为 5 ~ l ／ mi n ， 移植完 5 m i n后缓慢退针， 速度为 1 m m ／ m i n ， 用骨腊封口 1 ． 7 G F A P检测 ： 于再灌注各时间点断头处死大鼠， 取 右侧半球大脑入制备样品采用 We s t e rn B l o t t i n g法检 测 G F A P 1 ． 8 统计学方法 ： 将 We s t e r n ． B l o t 结果的胶片用数码 相机照像输入计算机 ， 用 Q u a n t i t y o n e图像分析软件对 各蛋白条带测灰度值 ， 用内参条带灰度值校正 ， 得 出各 条带的相对灰度值实验数据用 S P S S 1 3 ． 0 f o r w i n d o w s 统计软件进行分析 ， 以( 4 - S ) 表示 ， 组间均数 比较用配 对设计 t 检验 ， 各组 内均数 比较采用方差分 析 ( A N O ． V A) 检验 ， 以 P< 0 ． 0 5为有统计学意义。

2结果 三组组内各时 间点 G F A P的蛋白表达 比较 ： 见表 1 ， 图 1 再灌 注 1 、 2 、 3 、 5和 7周 ， G D N F ／ N S C s组 的 G F A P 蛋白显著高于N s 组 ( P< 0 ． 0 0 1 ) ； 再灌注 1 、 2 、 3 、 5周 ， N S C s组 G F A P蛋 白显 著 高 于 N S组 ( P < 0 ． 0 0 1 ) ， 并且 G D N F ／ N S C s 组 G F A P蛋白的表达显著高 于 N S C s 组( P< 0 ． 0 1 ) ， 见表 1 ， 图 1 ∞ 鼯 豁津 G F A P 暑 囊 — 一 鞠 G A P D H 毒 ’ GF AP 一 ’ - - ■ G A P D H 艺 嘲 ；蝴 ⋯G F A⋯ P ⋯ 一 _ ! I G A P D H 墨 一 一 ⋯3 w⋯5 w⋯⋯7 W⋯⋯⋯一一重 ⋯ 图 1 大鼠脑缺血再灌注后各 组 G F A P在脑组织 中表达 的 W e S t e r n b l o t 结果 四川医学2 0 1 3 年8月第3 4 卷( 第8期) S i c h u a n M e d i c a l J o u r n a l ， 2 0 1 3 ， V o 1 ． 3 4 ， N o ． 8 ·1 1 0 1· 注 ： 与 N S C s 组 比较 ， ①P< O ． 0 1 ； 与 N S组 比较 ， ②P< 0 ． 0 0 1 3 讨论 自从上世纪 9 0年代科学家们成功的分离培养 出 N S C s 后 ， 利用 N S C s 移植治疗神经系统疾病的研究成 为神经科学的热点。

其中， 研究较多的是移植 N S C s 治 疗缺血性脑损伤利用 N S C增殖和分化的特性 ， 通过 移植 N S C s 可以实现受损大脑神经功能的修复不 同 来源和不 同途径 的 N S C s 移植都可 以改善脑损伤后 的 运动和感 觉 功 能 - 5 ] 通 过 基 因工 程 将 营养 因子 N T ． 3等基 因转入 N S C s ， 然后把转基 因的 N S C s 移植 到 脑内 ， 结果显示外源性神经营养因子对神经组织提供 更好 的保护 J 胶质纤维酸性蛋 白( G F A P) 是一种分 子量为 5 0 - 5 2 K D a的酸性蛋白， 属细胞骨骼蛋白， 是星形胶质细胞 的标志蛋白在缺血脑损伤时， 刺激成熟星形胶质细 胞合成 G F A P， G F A P主要用于标记 损伤后胶质活动 损伤后增生的 G F A P阳性星形胶质细胞能促进星形胶 质细胞有丝分裂 ， 使原始祖细胞分化到成熟的星形胶 质细胞 各种中枢神经系统损伤均可引起星形胶质细 胞反应 星形胶质细胞反应的标志是细胞数增加 ， 胞 体肥大 ， 星形胶质细胞分支增多 ， 并且 G F A P的表达增 强。

因此 ， G F A P是星形胶质细胞 的标志 ， 反映星形胶 质细胞活化和增殖 C H o z u mi 【 等人将大鼠右侧受损脑 组织匀浆后行 G F A P免疫 印迹检 测， 结 果显示 ： 伤后 5—7 d实验 组 G F A P才开始增加， 明显高于假手术组， 3周时下降至 假手术组水平 ， 上述与本实验结果基本上一致本实 验 中 G D N F ／ N S C s 、 N S C s 和 N S组 比较 ， 再灌注 1 、 2 、 3 、 5 、 7周 ， G D N F ／ N S C s组 的 G F A P蛋 白显 著高于 N S组 ( P< 0 ． 0 0 1 ) ； 再灌注 1 、 2 、 3 、 5周 ， N S C s 组 G F A P蛋 白的表达显著高于 N S组( P< 0 ． 0 0 1 ) 由于 N S C组和 G D N F ／ N S C s 组有外源性神经干细胞 的加入 ， 移植的神 经干细胞向星形胶质细胞分化 ， 因此 N S C组和 G D N F ／ N S C s 组 的 G F A P蛋 白量 高于 N S组G D N F ／ N S c s 组 G F A P蛋白的表达显著高于 N S C s 组 ( P<0 ． 0 1 ) ， 说明 G D N F ／ N S C s 组在促 进星形胶质细胞活化 和增殖方 面 效果优于 N S C s 组 。

其具体机制可能是 ： G D N F基 因分 泌的 G D N F蛋白通过 自分泌 、 旁分泌的方式 ， 促进 内源 性和 外 源 性 N S C s的迁 移 、 增 殖、 分 化 并 向病 灶 迁 移 l 9 J ， 上调 G F A P的表达 ， 促进星型胶质细胞 的活化 和增殖 ， 进一步参与脑组织的神经保护 综上所述 ， 说明 G D N F ／ N S C s 通过明显改善局部微 环境条件 ， 增加内外源性 N S C s 的存活、 增殖和分化 ， 显 著改善 了暂时性脑缺血后大鼠的神经功能 其机制可 能与促进星形胶质细胞数有关 参考文献 ： [ 1 ] A b e K ．G e n e t h e r a p y a n d n e u rop ro t e e t i o n f o r c e r e b r a l i n f a r c t io n [ J ] ． R i n s h o S h i n k e i g a k u， 2 0 0 3 ， 4 3 ( 1 1 ) ： 8 9 4～8 9 6 [ 2 ] C h e n J L， Y i L i ， Wa n g L ， e t a 1 ．T h e r a p e u t i c b e n e fi t o f i n t r a v e n o u s a d - mi n i s t r a t i o n o f b o n e mB 1 T O W s t r o ma l c e l l s a f t e r c e r e b r a l i s c h e mi a i n r a t s [ J ] ．S t r o k e ， 2 0 0 1 ， 3 2 ( 4 ) ： 1 0 0 5～1 1 0 1 [ 3 ] 徐忠烨， 唐文渊． 经尾静脉移植神经干细胞对脑损伤大鼠的保护 作用[ J ] ． 中国神经精神疾病杂志 ， 2 0 0 6 ， 3 2 ( 4) ： 3 5 1～3 5 3 [ 4 ] H i r o k i T o d a ， J u n T a k a h a s h i ， N o b o r u l w a k a m i ， e t a 1 ．G r a f t i n g n e u r a l s t e m c e l l s i mp rov e d t h e i mp a i red s p a t i a l r e c o g n i t i o n i n i s c h e mi c r a t s [ J ] ．N e u res c i e n c e L e t t e r s ， 2 0 0 1 ， 3 1 6： 9—1 2 [ 5 ] K o n C h u ， M a n h o K i m， K y u n g — I I P a r k ， e t a 1 ． H u m a n n e u r a l s t e m c e l l s i mp ~v e s e 。