肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究医学论文.doc

肺腺癌患者血清生物标志物的筛选研究_医学论文 【摘要】 目的 采用SELDI-TOF-MS技术探讨肺腺癌患者血清蛋白标志物，并建立一个稳定、简便、快速的实验方法方法 肺腺癌患者321例和正常对照人群321例，按照年龄、性别、吸烟史的有无进行1:1配对，采用WCX2芯片技术进行血清蛋白质组学研究，用蛋白芯片阅读器PBSII对芯片进行扫描、分析结果 肺腺癌患者血清蛋白图谱与正常对照组相比，存在15个差异表达蛋白（P<10-5），其中包括11个高表达蛋白，分子量分别是1860Da、4055Da、4195Da、4211Da、4959Da、5329Da、5980Da、6313Da、6880Da、7762Da、9281Da，4个低表达蛋白，分子量分别是2564Da、2932Da、3082Da、3442Da显著高表达的潜在标志物5个，相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da和7762Da，以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53% 、72.60％，特异度分别为97.06%、93.44%、71.15%、76.36%、94.92％，选用4055Da、4211Da、4959Da、5329Da和7762Da建立决策树模型对样品进行筛选验证，其准确率为85.00%，灵敏度为86.67%，特异度为83.33%。

结论 用该技术能筛选出灵敏度和特异性较好的差异表达蛋白，为肺腺癌的早期发现提供了一种新的、无创伤的实验方法，可能具有较好的临床应用前景 【关键词】 肺腺癌；生物标志物；SELDI－TOF－MS；蛋白质组学The screening study on lung adenocarcinoma serum biomarkers by SELDI-TOF-MS【Abstract】 Objective To select relative specific biomarkers in serum from lung adenocarcinoma patients using surface-enhanced laser desorption and ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) protein chip technology.Methods Serum samples from 321 lung adenocarcinoma patients， 321 healthy volunteers with matched gender， age and history of smoking were analyzed using WCX2 potein chip to screening potentially biomarkers. Proteomic spectra were generated by mass spectrometry.Results Five highly expressed potential biomarkers were identified with the relative molecular weights of 4055Da， 4211Da， 4959Da， 5329Da and 7762Da. The sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma was 90.41%， 78.08%， 50.68%， 57.53%， 72.60%; and specificity was 97.06%， 93.44%， 71.15%， 76.36%， 94.92%， when the critical point was made 1.5. The sensitivity for diagnosing lung adenocarcinoma was 86.67%， and specificity was 83.33% by applied to this protein fingerprints pattern validation.Conclusion SELDI-TOF-MS protein chip technology is a quick， easy， convenient， and high-throughput analyzing method capable of selecting several relatively specific， potential biomarkers from the serum of lung adenocarcinoma patients and may have attractive clinic value.【Key words】 lung adenocarcinoma; biomarkers; SELDI-TOF-MS; proteomics肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤之一，对人类健康的危害日益严重。

目前，肺癌早期诊断困难80%肺癌患者就诊时已属晚期， 失去了手术根治的机会，放疗化疗效果不佳， 5年生存率不到15%；而早期肺癌手术后5年存活率达70%［1］，但肺癌早期确诊率只有约15%，故肺癌总的预后不良，与肺癌缺乏有效的早期诊断手段有关因此，寻找灵敏度、特异性高的早期诊断方法是目前临床亟待解决的问题之一蛋白质组学作为后基因组学时代的重要研究工具，在肿瘤研究中已广泛应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption Ionization time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS）是一种新兴的蛋白质组学研究技术使用这种技术，组分复杂的生物样品(如细胞液或体液)中的各种蛋白质通过特定的表面基团吸附于蛋白质芯片上，用激光脉冲辐射使结合在芯片上的蛋白质解析形成荷电离子，这些不同质荷比的离子在真空电场中飞行的时间长短不同，据此绘制出质谱图，可以简便、快速地获得各种蛋白质的分子量、丰度等信息本研究使用SELDI技术，检测已明确诊断肺腺癌的患者血清样本，绘制蛋白质质谱图，分别与正常人进行比照，筛选出肺腺癌显著高表达的潜在标志物5个，并建立决策树模型对样品进行筛选。

寻找肺癌发生 发展 的生物标志物，从而为肺癌的早期诊断提供新的依据1 对象与方法 1.1 研究对象1.1.1 样本来源 来自上海长征 医院 等收治的肺腺癌患者321例，其中男187例，女134例，平均年龄60.25±11.58岁(29～76岁)321例肺腺癌患者均手术后病理证实为肺腺癌所有肺腺癌患者于术前抽取清晨空腹前臂静脉全血5ml正常人群321例，男167例，女154例，平均年龄60.23±7.53岁(28～76岁)， 均为无疾病证据的医务人员及健康体检者分别抽取清晨空腹前臂静脉全血5ml1.1.2 实验分组 642例样品中，100例（50例患者、50例对照）用于检测后建立决策树模型，随机抽取60例（30例患者、30例对照）用于建模后的筛选研究1.2 方法1.2.1 血清标本制备 上述所有肺腺癌患者和正常志愿者的静脉血标本，于4℃下3000转/min离心10min，取血清，分装后保存于－80℃冰箱1.2.2 蛋白质芯片检测 （1）平衡芯片：取50mmol/L pH=3.0的醋酸钠（NaAc）溶液200μl/孔加入芯片的加样孔中，平衡芯片2次，每次5min2）血清样品稀释：取6μl血清样品，加入234μl 50mmol/L pH=3.0的NaAc溶液中，混匀稀释。

3）芯片上样：取稀释后的血清样品200μl/孔加入芯片的加样孔，置芯片于摇床混匀90min4）样品洗脱：取50mmol/L pH=3.0的NaAc溶液200μl/孔加入芯片加样孔，洗脱2次，每次5min取300μl/孔的去离子水冲洗芯片5）蛋白质获能：取能量吸收剂SPA（含饱和芥子酸溶于50 %乙腈和0.15 %三氟乙酸）1μl/孔加入芯片加样孔，待 自然 挥发后再重复加能量吸收分子SPA1次所有操作均应在4℃条件下进行（插入碎冰中）6)芯片检测:将芯片置入Protein Chip Biomarker System Ⅱ质谱仪处理， 以激光强度160， 作用时间90ns，经 计算 机形成血清蛋白质质谱图（其中纵坐标为蛋白质相对含量，横坐标为蛋白质质荷比，见图1）1.2.3 数据处理 用Ciphergen Protein Chip软件和BioMarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据进行处理，所有测得的蛋白质图谱进行统一标准化采用Biomarker Pattern Software建立决策树模型两组间蛋白峰相对强度值的比较应用t检验进行统计分析2 结果 2.1 肺腺癌患者与正常人群血清中蛋白质波谱峰的比较 肺腺癌患者与正常人血清差异表达蛋白筛选情况，见图2。

2.2 差异表达蛋白质诊断肺腺癌的价值评价 筛选出的五个肺腺癌差异表达蛋白质波峰的相对分子量分别为4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da， 分别以峰值比1.5为界值时， 其诊断肺腺癌的灵敏度分别为90.41%、78.08%、50.68%、57.53%、72.60％，特异度分别为97.06%、93.44%、71.15%、76.36%、94.92％（见表1）表1 肺腺癌高表达蛋白质波峰（略）2.3 选择差异表达蛋白建立决策树模型 肺腺癌的判断模型由Ciphergen公司Biomarker Pattern Software（BPS）完成，通过选择差异蛋白峰建立决策树模型BPS自动选用4055Da、4211Da、4959Da、5329Da、7762Da（M/Z）建立模型可以显著区分2组患者（见图3略）图3表示，此决策树具有3层5个叶节点，100例样本在根节点处被7762Da（节点1）标志蛋白划分为两组，峰值≤48.530的51例样本进入节点2，后用4211Da标志蛋白划分，39例判断为对照，12例判断为患者进入节点4，后用4959Da标志蛋白划分，8例判断为对照，4例判断为患者；峰值>48.530的49例样本进入节点3，后用5329Da标志蛋白划分，1例判断为对照，48例判断为患者进入节点5，后用4055Da标志蛋白划分，2例判断为对照，46例判断为患者。

2.4 建模后双盲筛选 随机抽取60例（30例患者、30例对照）血清，用WCX2芯片得到其蛋白质图谱后，进入该决策树模型，该模型判断认为60例中28例为肺腺癌，32例为正常和病史资料对照后，30例肺腺癌患者中26例被准确判断为肺腺癌，4例被判为正常对照；30例正常对照中25例被准确判断为正常对照，5例被判为肺腺癌决策判断模型的盲法验证的准确率为85.00%［（26+25）/60］，灵敏度为86.67%（26/30），特异度为83.33%（25/30）3 讨论 肺癌早期常无明显临床症状，且缺乏临床可实用的肺癌诊断、监测用标志物，极易延误诊断，因此寻找肺癌相对特异性肿瘤标志物很有必要作为肺癌诊断的传统方式，胸片及显微镜下找痰中脱落的癌细胞已临床应用了很多年但国外已有大型随机对照研究［3］发现胸片及痰找脱落细胞并不能足够早地发现肺癌，不能明显地降低因肺癌致死的危险如果能有快速、简便、易于为患者接受且准确可靠的诊断方式与高排螺旋CT可早期发现肺部小结节的优势相结合必将大大提高肺癌的早期诊断率，使患者获益新兴的蛋白质组学研究技术为满足这样的临床需求带来了希望的曙光 表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（surface-enhanced laser desorption Ionization ti。