果酒酵母发酵.doc

北方民族大学实验报告学院：生物科学与工程学院专业：生物工程实验题目：果酒酵母发酵班级：生物工程101姓名：0000学号：20103374 四组成员：果酒酵母发酵选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏一、实验目的和内容1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）2．用实验十三所筛选果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精）二、实验原理 果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳可用以下反应式来说明：　　果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物　　果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。

按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式三、实验仪器与材料样品：新鲜水果及压榨汁试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)或者红土；器皿：三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（0.5×1.2 cm）冰箱，低温冰箱（-30 ℃），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等四、实验方法与步骤1．自选酵母发酵性性能的检测试验：用筛选菌种发酵果酒（1）果酒酿造的工艺流程 鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→ 发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品 （2）工艺简述 1）发酵前的处理前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等①破碎、除梗： 破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。

②二氧化硫处理： 二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L以葡萄酒为例：二氧化硫添加量的计算：[葡萄果实×70%×60]/[0.06×1000]此外，尚需考虑下述因素：原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加 2）果汁的调整： 取汁测定果汁中糖度和酸度，根据发酵需要调整糖度和酸度①糖的调整： 酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需 17-20°Bx如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁②酸的调整： 酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性干酒易在0.6%-0.8%，甜酒0.8%-1%一般pH大于3.6或可滴定酸低于0.65%时应该对果汁加酸 3）酒精发酵发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的4/5，然后加入 3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28 ℃，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。

残糖降为0.4%以下时主发酵结束 糖度的测定：费林试剂比色法试剂：费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中0.25％葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml2）器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管操作步骤 ：1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和比预备试验少 1 mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

计算式中： F——费林溶液A、B各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；m——称取葡萄糖的质量，g；V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于 100 mL容量瓶中，使之所含还原糖量为 0.2～0.4g，加水定容至刻度吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积按式（4）计算4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总糖量为 0.2～0.4 g，加 5 mL盐酸溶液，加水至 20 mL，摇匀于 68±1℃水浴上水解 15 min，取出，冷却用200 g／L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH溶液滴定至微红色）调温至 20℃，加水定容至刻度（V2）吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于 250 mL三角瓶中，加 50 mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加 2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

按下式计算 式中：X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL所得结果应表示至一位小数酸度的测定：中和滴定法试剂 酚酞指示剂溶液，10g/L ：称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)＝0.1mol/L1）配制 将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀 2）标定 称取0.6 g于105～110 ℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001 g溶于50 mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点同时做空白试验 3）计算 按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：C＝ m/(V1-V2) ×0.2042 式中：C ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L； m ——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V ——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1 ——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。

操作步骤1）样品的测定 取调温至20 ℃的样品2.00-5.00 mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250 mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1 起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定 2）空白的测定 吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同13）结果计算 按下式计算滴定酸的量，以g/L表示： 式中：X ——样品中滴定酸的含量，g/L；c ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1 ——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0 ——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL； V2 ——吸取样品的体积，mL； Si ——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量 S酒石酸＝0.075；S苹果酸＝0.067；S柠檬酸＝0.064；S草酸＝0.045酒度的测定：蒸馏法材料 全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。

操作步骤1）用一洁净、干燥的 100 mL容量瓶准确量取 100 mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温 20℃）于500 mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL 2）将试样倒入洁净、干燥的100 mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度所得结果表示至一位小数结果分析一）主发酵各时期的特征：（1）发酵初期,主要是酵母菌的繁殖阶段 特征: 液面平静 气泡产生 品温渐高 甜味尚浓 比重较大 酒味产生（2）发酵中期，主要是酒精发酵阶段特征: 气泡剧增 液面沸腾 酒帽浮起 品温高升 甜味渐淡 酒味渐浓（3）发酵末期 特征: 气少液平 品温渐低 甜味极淡 酒味最浓 浮渣下沉 酒液变清二）糖度随时间的变化天数123456789糖度/l16012583.553.134.524.615.210.36.5果浆中含糖量随时间的变化曲线三）酸度随时间的变化天数1234567酸度/l1.8753.754.54.54.65.156.15四）酒精度通过蒸馏法测得酒精度为8℃.。

结论通过实验得出影响酵母生长和发酵的主要因素1.温度：最适生长温度25~28 ℃；13~14℃发酵起动困难，随温度升高发酵加快，35。