疫细胞功能检测技术.ppt

第十五章第十五章 免疫细胞功能检测技术免疫细胞功能检测技术第一节第一节 淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验体内实验主要是间接了解淋巴细胞对实验体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定细胞分泌产物的测定 淋巴细胞淋巴细胞ØT T细胞（负责细胞免疫功能）细胞（负责细胞免疫功能）ØB B细胞（执行体液免疫功能）细胞（执行体液免疫功能）ØNKNK细胞（非特异性免疫作用）细胞（非特异性免疫作用） 一、一、T细胞功能的检测细胞功能的检测ØT T细胞增殖试验细胞增殖试验ØT T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定ØT T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验Ø体内试验体内试验（一）（一）T T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验1. 1. 原理：原理：淋巴细胞淋巴细胞DNADNA合成合成分化分化母细胞母细胞刺激物刺激物细胞变大细胞变大细胞浆扩大细胞浆扩大空泡空泡核仁明显核仁明显核染色质疏松核染色质疏松2. 2. 淋巴细胞转化的刺激物淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：非特异性刺激物： PHA ------T PHA ------T细胞细胞 ConA -------T ConA -------T细胞细胞 PWM -------T PWM -------T、、 B B细细胞胞 LPS -------B LPS -------B细胞细胞特异性刺激物：特异性刺激物： 异种抗原异种抗原 同种组织抗原同种组织抗原 3. 3. 检测方法检测方法 形形态态法法：：刺刺激激物物 淋淋巴巴细细胞胞（（4-64-6天天）） 母母细细胞胞化化 同位素法：同位素法：PHA PHA 淋巴细胞（淋巴细胞（54h54h）） DNA DNA合成期合成期 + + 3 3HTdRHTdR掺入掺入 收集细胞收集细胞   检测检测ββ射线射线 测定细胞内的测定细胞内的3H3H－－TdRTdR（（1 1）形态学检查法）形态学检查法方法学评价：方法学评价：Ø优点：形态学方法简便易行，普通光优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。

室应用Ø缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差准确性较差 培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（（2 2））3H-TdR3H-TdR掺入法掺入法Ø优点：优点：3H-TdR3H-TdR掺入法敏感性高，客观性掺入法敏感性高，客观性强，重复性好强，重复性好Ø缺点：但需一定设备条件，同时还存在缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题放射性核素污染问题培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(3) MTT (3) MTT 比色法比色法( (二二) T) T细胞分泌功能测定细胞分泌功能测定 体外培养的体外培养的T T细胞经各种丝裂原或抗原刺细胞经各种丝裂原或抗原刺激后激后, ,分泌各种细胞因子分泌各种细胞因子, ,可借助免疫学、细胞可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映量、生物学活性或基因表达水平，以反映T T细细胞功能。

胞功能 （三）（三）T T细胞介导的细胞毒试验细胞介导的细胞毒试验1.1.原理：原理：靶细胞抗原靶细胞抗原T T细胞细胞观察杀伤活力观察杀伤活力致敏致敏CTLCTL靶细胞靶细胞Ø形态学方法：淋巴细胞形态学方法：淋巴细胞+ +肿瘤细胞肿瘤细胞 计数计数残留肿瘤细胞残留肿瘤细胞2.2.方法方法意义：意义： 肿瘤患者肿瘤患者CTLCTL杀伤肿瘤细胞的能力杀伤肿瘤细胞的能力 靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时5151CrCr释放法释放法( (四四) ) 体内试验体内试验Ø特异性抗原皮肤试验特异性抗原皮肤试验ØPHAPHA皮肤试验皮肤试验 二、二、B细胞功能检测细胞功能检测ØB B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验Ø溶血空斑试验溶血空斑试验ØB B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测Ø体内试验体内试验( (一一)B)B细胞增殖能力的试验细胞增殖能力的试验抗抗IgMIgM细菌脂多糖细菌脂多糖SACSAC的的SPASPAB B细胞增殖细胞增殖形态学形态学3 3H H－－TdRTdR掺入法掺入法( (二二) ) 溶血空斑试验溶血空斑试验1. 1. 原理：原理：2. 2. 方法学：方法学：Ø经典溶血空斑形成试验经典溶血空斑形成试验Ø被动溶血空斑试验被动溶血空斑试验 3 3．临床应用与评价．临床应用与评价Ø溶血空斑试验主要用于测定药物和溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响手术等因素对体液免疫功能的影响Ø评价免疫治疗或免疫重建后机体产评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

生抗体的能力 ( (三三) )　　 B B细胞抗体形成功能的检测细胞抗体形成功能的检测 —— ——酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法1.原理：原理：2 2．应用与方法学评价：．应用与方法学评价：Ø该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量测抗体分泌量Ø优点：优点：稳定、特异、抗原用量少；稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞( (四四) )　体内试验　体内试验Ø体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等Ø将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后前及免疫后1 1周、周、2 2周、周、3 3周分别采血，分离血周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内断受检者体内B B细胞的功能。

细胞的功能染色计数染色计数离心取上清离心取上清测测LDHLDH或或AKPAKP离心取沉淀离心取沉淀测活细胞荧光测活细胞荧光测发光强度测发光强度测测CPMCPM值值Ø形态法形态法Ø酶释法酶释法Ø荧光法荧光法Ø同位素法同位素法Ø化学发光法化学发光法三、三、NK细胞活性测定细胞活性测定靶靶细细胞胞溶溶解解常用靶细胞常用靶细胞: : K562细胞株第二节第二节 吞噬细胞功能检测技术吞噬细胞功能检测技术 按其形态大小分为两类：按其形态大小分为两类：大吞噬细胞大吞噬细胞——单核单核- -吞噬细胞系统吞噬细胞系统小吞噬细胞小吞噬细胞——中性粒细胞中性粒细胞吞噬细胞的功能：吞噬细胞的功能： 趋化趋化 吞噬吞噬 胞内杀灭作用胞内杀灭作用 一、中性粒细胞功能的检测一、中性粒细胞功能的检测Ø 细胞趋化功能的检测细胞趋化功能的检测Ø 吞噬和杀菌功能的检测吞噬和杀菌功能的检测( (一一) ) 细胞运动功能细胞运动功能————趋化功能检测趋化功能检测1.1.原理：原理：2. 2. 方法学：方法学：琼脂糖平板法琼脂糖平板法 滤膜渗透法（滤膜渗透法（Boyden 小室法）小室法）( (二二) )吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定 1 1．显微镜检查法：．显微镜检查法：2. 2. 溶菌法溶菌法NBTNBT还原试验还原试验 原理：原理：N-N-C + H+N=N-R-N-NH2C N=NH四氮唑基（淡黄色）四氮唑基（淡黄色）甲甲chan（紫黑色）（紫黑色）3 3．．NBTNBT还原试验还原试验 中性粒细胞中性粒细胞NBTNBT甲撍颗粒沉积于胞质中甲撍颗粒沉积于胞质中二、巨噬细胞功能检测二、巨噬细胞功能检测( (一一) )炭粒廓清试验炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%10%炭粒。

据炭粒据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁此给小鼠定量静脉注射印度墨汁( (炭粒悬液炭粒悬液) )，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能判断巨噬细胞的功能( (二二) )吞噬功能检测吞噬功能检测 巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能，常用鸡红细胞吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)(CRBC)、白色念珠、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞 ( (三三) )巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定1 1．酸性磷酸酶的测定．酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法硝酸铅法 偶氮法偶氮法2 2．非特异性酯酶的测定．非特异性酯酶的测定 常用常用α-α-萘醋酸法萘醋酸法( (四四) ) 细胞毒作用测定细胞毒作用测定 用用IFN-γIFN-γ激活小鼠巨噬细胞，观察其激活小鼠巨噬细胞，观察其对对125125I-UdRI-UdR标记的标记的DBA/2DBA/2小鼠肥大细胞瘤小鼠肥大细胞瘤P815P815的杀伤活性。

的杀伤活性( (五五) ) 巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定 激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，的凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为此取已经为此取已经37℃37℃预温的正常兔血浆和预温的正常兔血浆和CaClCaCl2 2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置管中，移置37℃37℃，即时记录血浆凝固时间即时记录血浆凝固时间Ø反映机体免疫功能状态反映机体免疫功能状态Ø肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测Ø组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现，以便监测则有利于排斥反应的早期发现，以便及时采取有效措施及时采取有效措施第三节第三节 免疫细胞功能检测的临床应用免疫细胞功能检测的临床应用思考题思考题1.1.T T细胞功能检测内容有哪些？细胞功能检测内容有哪些？2.2.什么是什么是T T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学？？3.3.何谓何谓T T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学？4.4.何谓结核菌素皮肤试验？何谓结核菌素皮肤试验？5.5.B B细胞功能检测的方法学有哪些？细胞功能检测的方法学有哪些？6.6.何谓溶血空斑试验的原理和方法学？何谓溶血空斑试验的原理和方法学？7.7.NKNK细胞活性测定的方法学有哪些？细胞活性测定的方法学有哪些？8.8.中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。

中性粒细胞功能检测方法学及相应原理9.9.巨噬细胞功能检测方法学及相应原理巨噬细胞功能检测方法学及相应原理10.10.免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？免疫细胞功能检测的临床应用有哪些？重点免疫细胞功能检测试验名称选择题1.Boyden小室常用于测定（ ）A.白细胞吞噬功能B.中性粒细胞趋化功能C.白细胞杀伤功能D.淋巴细胞抑制功能E.白细胞调理功能2.溶血空斑试验用于检测下列何种细胞的功能（ ）A.T细胞B.B细胞C.中性细胞D.吞噬细胞E.NK细胞3.T细胞增殖试验的检测方法（ ）A.滤膜渗透法B.3H-TdR掺入法C.酶联免疫斑点法D.51Cr释放法E.NBT还原法。