反硝化能力的测定.docx

摘要：为深入研究一农田系统中的反硝化过程，本课题进行了农田土壤样本的反硝化细菌分离和16S rRNA基因鉴定，并分析了它们的反硝化能力与反硝化基因通过对土壤样本进行初筛和复筛，以限制氮源的方法分离出8株具有反硝化能力的微生物，对5株微生物的反硝化能力进行测定，硝酸盐降解率最高为100%，最低为66.76%对8株分离的反硝化菌株的DNA进行反硝化基因nirS和nosZ进行PCR扩增，结果发现有三株菌株含有nosZ基因，均未检测到nirS基因对分离的反硝化菌株的16S rDNA进行PCR扩增，通过克隆建库和阳性克隆测序的方法对分离菌株进行了分类地位的分子鉴定结果表明分离的菌株属嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、中间气单胞菌（Aeromonas media）、居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola）而居泉沙雷氏菌没有有反硝化能力的报道，对我们增加对反硝化细菌的认识有很大帮助 关键词：反硝化微生物，菌种鉴定，反硝化菌筛选, 反硝化基因 1、绪论： 反硝化作用（denitrification）也称脱氮作用反硝化细菌在缺氧条件下，还原硝酸盐，释放出分子态氮（N2）或一氧化二氮（N2O）的过程。

大部分反硝化细菌是异养菌，例如脱氮小球菌、反硝化假单胞菌等，它们以有机物为氮源和能源，进行无氧呼吸，其生化过程可用下式表示： C6H12O6+12NO3-→6H2O+6CO2+12NO2-+能量 CH3COOH+8NO3-→6H2O+10CO2+4N2+8OH-+能量 反硝化作用使硝酸盐还原成氮气，从而降低了土壤中氮素营养的含量，对农业生产不利农业上常进行中耕松土，使土壤与氧气充分接触以防止反硝化作用反硝化作用是氮素循环中不可缺少的环节，可使土壤中因淋溶而流入河流、海洋中的NO3-减少，消除因硝酸积累对生物的毒害作用所以我们应尽量发挥其有利的一面，为人类所利用 反硝化微生物对于硝酸根离子的还原步骤如右图，若要从微生物代谢角度验证菌株是否为反硝化菌最简单有效的方法便是测定nirS和nosZ基因是否存在由于N2O和NO都是温室气体，是否含有nosZ基因对于菌种的用途有着实际且重要的意义，即可以使土壤中微生物代谢产生的N2O和NO还原成氮气[1]本实验的目的便是通过筛选土壤中的反硝化菌，测定反硝化能力，鉴定其是否含有nirS和nosZ基因，对此进行综合分析，找出在农田土壤中发挥反硝化作用的不同的菌株，为了解土壤中的反硝化机制奠定基础。

分离的菌株将有可能具有应用前景例如，nosZ基因活性较强的菌株将对农田等生态系统中其他微生物产生的N2O和NO等温室气体还原，减少温室气体的排放，为维持环境的稳定起到积极作用 2、实验材料与方法2.1 本研究所用的土壤样品采自挪威的农田挪威农业发展中心于1978年开始向当地泥炭土中添加冰碛土（moraine soil）和贝壳砂（shell sand）改良土壤本次实验所用土壤即来自于改良项目中的一项（每公顷添加800m3贝壳砂），经近三十年的改良，土壤的pH已从4左右上升到了8左右，土壤肥力等方面都有所改善挪威农业大学对该农田地块进行了为期三十年的长期监测，积累了大量的农田的理化和农业数据[2] 2.2 培养基： LB液体培养基 (每1000ml) 10g蛋白胨 5g酵母提取物 10g NaCl 若加入15g琼脂粉则为LB固态培养基成分 TSA培养基 胰蛋白胨0.75g/L 大豆胨 0.25g/L NaCl 0.25g/L Giltay培养基：A溶液：KNO3 1.0g天冬酰胺1.0g，1%BTB酒精溶液5mL，蒸馏水500mL B溶液：柠檬酸钠8.5g， MgSO4·7H2O 1.0g，FeCl3·6H2O 0.05g，KH2PO41.0g，CaCl2·2H2O 0.2g，蒸馏水500mL， 混合A、B溶液，加入1%mol/L的NaOH溶液调节pH为7.1，灭菌备用 2.3 仪器、试剂： 普通离心机、超净台、恒温培养箱、摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、紫外分光光度仪、实验所用化学药品均为分析纯。

2.4 初筛： 先将土壤样本稀释100倍作为样本提取样本，稀释为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8六个梯度，各500微升其中， 10-5、10-6、10-7三个浓度各涂两个平板，其余各涂一个平板再加上10-2浓度在平板上进行划线，总计10个平板平板上培养基为TSA培养基然后将平板放入厌氧培养箱中18℃培养一个星期 2.5 菌落集中培养： 另取一平板，在其背面贴上50格的方格纸，然后从10-6和 10-7的平板上挑取菌体分别接种在每个格子的左上（记为A）和右下方（记为B）其上菌落的编号方法：方格号+位置，例：10A、44B）共计100个菌落将此平板与先前各平板一道放入厌氧培养箱继续培养一周此平板记作此平板记作此平板记作此平板记作 “平板平板平板平板A” 2.6 复筛： 使用移液枪头挑取平板A上较明显且较有代表性的10个菌落接种进预先加好Giltay培养基与BTB的大试管内，记下编号，培养一周 接种到大试管中的细菌编号： 17A、17B、19A、19B、23A、23B、38B、41A、42A、43A BTB变蓝的试管编号： 17A、17B、19A、19B、23A、38B、41A、43A。

将所有平板密封放入冰箱保存，将大试管放入振荡培养箱继续培养一周后，提取大试管中的培养液，开始测量硝酸盐的降解程度此时，菌已在大试管中培养三周（28℃）使用仪器为紫外分光光度仪，波长为220nm与275nm记录实验数据，将结果进行数学模型拟合，推算出硝酸盐降解程度。