荧光原位杂交FISH试验步骤.doc

仪器设备1 、医用微波炉；2 、水浴锅；3 、OLYMPUS BX5荧光显微镜；4 、OLYMPUS DPI数字显微照相机FISH试齐U(1) 1X PBS由10X PBS溶液稀释而成，储存于4C；(2) 20X SSC( pH7.0);(3) 2X SSC由20X SSC溶液稀释而成；(4) 25mg/ml蛋白酶K消化液5) 变性液(70 %甲酰胺+2X SSC pH7.0) : 4ml 20 X SSC 8ml蒸馏水；28ml甲酰胺每 次新鲜配制6) 杂交后洗涤液：20X SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml每次新鲜配制调节pH 前升至室温实验步骤1 、脱蜡：1 )二甲苯脱蜡3次，每次5min；2 ) 100%酒精两次，每次2min；3 )移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥2 、蛋白酶处理：1 )每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2X SSC40ml倒人Facal管，在水 浴槽中预热将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解2 ) 37C水浴槽中预热染色缸和蛋白酶 K溶液37C孵育20min3 ) X SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min4 )梯度酒精脱水(-20C预冷)。

3 、变性：1 )每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2 ) 78E水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3 ) 78E 孵育 8min；4 )即移入-20C预冷70%酉精的染色缸内2min，再依次移入80% 90呀口 100%勺-20C预冷 酒精内，每缸2min；5 )空气干燥4 、杂交：1 )准备探针；2 )取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3 )滴10卩l探针在切片的组织上，加盖玻片；4 )盖上湿盒盖，37 E孵育12h〜16h杂交后的水洗：5 )镊子小心去除盖玻片；6 ) 43E预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7 ) 2X SSC(37C)洗两次，每次 10min；8 )切片放人染色缸的1X PBS内待检测，勿使切片干燥检测：9 ）从1X PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥把切片放入湿盒内，同时处 理4张切片10 ）每张切片使用30卩l〜60卩l罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11 ）去掉塑料盖膜，把切片放入含 1X PBS的染色缸1X PBS室温下洗3次，每次2min 扩增：12 ）从1X PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13 ）每张切片滴30卩l〜60卩l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20min；14 ）去掉塑料盖膜，把切片放人含 1X PBS的染色缸。

1X PBS室温下洗3次，每次2min；15 ）从1X PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16 ）每张切片滴30卩l〜60卩l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育 20min；17 ） 1X PBS室温下洗3次，每次2min5 、细胞核染色：1 ）张切片加10卩l〜20卩l DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育 2〜5ml;2 ）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在 -20C冰箱切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察PRINS步骤1 、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS ；2 、用0.2mol/L盐酸处理5min；3 、蛋白酶 K（25 卩 g/m1）消化 37C 15min ；4、分别用80%, 95%和100%酒精脱水，室温干片；5 、加 PCR昆合液 25 卩 L（10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCI2,各加 200 卩 mol/L dATP dCTP dGTP 1.5mmol/L dig-11-dUTP l.5 卩 l，引物 250ng, Taq DNA聚合酶 2U），加盖片；6 、94°C变性5min后置入65°C湿盒中5min；7 、用 0.1 X SSC液，65C洗 5min；8 、片于 65C 10s 〜20s；用 4X SSG0.1 %吐温 20 液 42C洗 5min, 2 次；9、 经Buffer I 液洗后滴加20%羊血清封闭30min；10、 加地高辛抗体复合物（1:500）室温下2h；11 、Buffer 川液洗 5min；12 、用BCIP-NBT显色1h〜2h,在镜下控制，终止显色；13 、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。