消毒和灭菌效果的评价方法和标准.doc

中华人民某国国家标准 消毒与灭菌效果的评价方法与标准 GB15981-1995Evaluating method and standard for the efficacy of disinfection and sterilization第一篇　压力蒸汽灭菌效果评价方法与标准1　主题内容与适用X围本方法规定了压力蒸汽灭菌技术标准及其评价灭菌效果的检测方法　　本方法适用于对压力蒸汽灭菌设备灭菌效果的评价2　试剂　　本标准所用试剂，凡未说明规格者，均为分析纯(AR)，水为蒸馏水2.1蛋白胨2.2葡萄糖2.3溴甲酚紫酒精溶液：取溴甲酚紫2.0g，溶于100mL95%乙醇中2.4溴甲酚紫蛋白胨水培养基配制：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，溶于1000mL蒸馏水中，调pH值至7.0～7.2，然后再加2%溴甲酚紫酒精溶液0.6mL，摇匀后，按5mL/管，分装包口，置压力蒸汽灭菌器中，于115℃灭菌40min后备用3　指示菌嗜热脂肪杆菌芽胞(ATCC 7953或SSI K31)菌片，含菌量为5×105～5×106cfu/片，121℃下，杀灭90%微生物所需时间D121值为1.3～1.9min，杀灭时间(KT值)为≤19min，存活时间(ST值)为≥3.9min。

4　化学指示剂需用卫生部批准的化学指示剂5　技术要求压力蒸汽灭菌器压力，MPa/cm2温度，℃灭菌时间，min下排气式0.070115400.10512130预真空式0.2101344-66　检测方法6.1生物学指标(用作压力蒸汽灭菌设备灭菌效果的依据)6.1.1将嗜热脂肪杆菌芽胞菌片两个分别放入灭菌小纸袋内，置于标准试验包中心部位6.1.2灭菌柜室内，上、中层中央和排气口处各放置一个标准试验包(由3件平纹长袖手术衣，4块小手术巾，2块中手术巾，1块大手术巾，30块10cm×10cm、8层纱布敷料包裹成25cm×30cm×30cm大小)手提压力蒸汽灭菌器用通气贮物盒(22cm×13cm×6cm)代替标准试验包，盒内盛满中试管，指示菌片放于中心部位两只灭菌试管内(试管口用灭菌牛皮纸包封)，将盒平放于手提压力蒸汽灭菌器底部6.1.3经一个灭菌周期后，在无菌条件下，取出标准试验包或通气贮物盒中的指示菌片，投入溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培养基中，56℃培养48h，观察培养基颜色变化6.2化学指标在物品包外用化学指示胶带，可作为物品是否经过灭菌的处理标志在物品包内中心部位用化学指示剂，可作为物品是否灭菌的参考标志。

7　结果判定及评价7.1同次检测中，标准试验包或通气贮物盒内，每个指示菌片接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基全部不变色，判定为灭菌合格指示菌片之一接种的溴甲酚紫蛋白胨水培养基由紫色变为黄色时，判定为灭菌不合格7.2化学指示剂的颜色变为与灭菌合格标准色相同时，或熔化时作为灭菌合格的参考标准第二篇　紫外线表面消毒效果评价方法与标准8　主题内容与适用X围本方法规定了物体表面消毒用紫外线的波长、强度及评价其消毒效果的物理学指标和生物学检测方法　　本方法适用于紫外线直接照射到的物体表面消毒效果评价9　指示菌9.1大肠杆菌(8099或ATCC 25922)9.2枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC 9372)10　物理学指标10.1在电压220V时，普通30W直管型紫外线灯，在室温为20～25℃的使用情况下，253.7nm紫外线辐射强度(垂直1m处)应≥70μW/cm210.2在电压220V时，高强度紫外线灯，在室温为20～25C的使用情况下，253.7nm紫外线辐射强度(垂直1m处)应≥200μW/cm210.3照射剂量按式(1)计算：　　剂量(μW·s/cm2)＝强度(μW/cm2)×时间(s)………………………(1)11　检测方法11.1物理学检测方法11.1.1灯管的紫外线强度(μW/cm2)用中心波长为253.7nm的紫外线强度测定仪(标定有效期内)，在灯管垂直位置1m处测定。

11.1.2在实际应用中消毒表面的照射强度应以灯管与消毒对象的实际距离测定11.1.3表面消毒接受的照射剂量，应达杀灭目标微生物所需对大肠杆菌，照射剂量应达到20000μW·s/cm2，对枯草杆菌黑色变种芽胞应达到100000μW·s/cm211.2生物学检测方法11.2.1采用载体定量消毒试验载体制备按本标准附录C进行11.2.2开启紫外线灯5min后，将8个染菌玻片平放于灭菌器皿中，水平放于适当距离照射，于4个不同间隔时间各取出2个染菌玻片，分别投入2个盛有5mL洗脱液(1%吐温80，1%蛋白胨生理盐水)试管中，振打80次11.2.3经适当稀释后，取0.5mL洗脱液，作平板倾注，每个染菌玻片接种两个，放37℃培养48h作活菌计数11.2.4阳性对照，除不作照射处理外，取2个染菌玻片分别投入2个盛有5mL洗脱液中振打80次，余按4.2.3进行11.2.5计算杀灭率 阳性对照回收菌数 – 试验组回收菌数杀灭率（%）= ×100······（2） 阳性对照回收菌数12　判定标准12.1对指示菌杀灭率≥99.9%判为消毒合格。

12.2达物理学检测标准时，作为消毒合格的参考标准第三篇　液体消毒剂消毒效果评价方法与标准13　主题内容与适用X围本方法具体规定了消毒剂消毒效果生物学检测方法及其评价标准　　本方法适用于消毒剂对各种物体的消毒效果评价14　理化指标置20±2℃水浴中，测定在使用浓度下杀灭指示微生物达到消毒或灭菌所需的最短时间(min)15　指示微生物15.1细菌15.1.1细菌繁殖体：金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(8099或ATCC 25922)15.1.2细菌芽胞：枯草杆菌黑色变种芽胞(ATCC 9732)15.2真菌：白色念珠菌(ATCC 10231)15.3乙型肝炎表面抗原：纯化抗原(1.0mg/mL)16　检测方法16.1中和试验(见附录 A)16.2消毒剂定性消毒试验(见附录 B)16.3消毒剂定量消毒试验(见附录 C)16.4消毒剂杀菌能量试验(见附录 D)16.5乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原性破坏试验(见附录 E)17　消毒效果评价标准17.1对细菌和真菌的杀灭率≥99.9%，对HBsAg，将检测方法灵敏度104倍或5×104倍(载体试验)的HBsAg抗原性破坏，可判为消毒合格。

17.2对枯草杆菌黑色变种芽胞全部杀灭，可判为灭菌合格17.3在实际应用中消毒效果评价以有机物保护试验的最低浓度和最短时间为该消毒剂达到实用消毒所需的浓度和时间附录A中和剂中和效果试验(补充件)A1 内容提要　　为了准确评价消毒剂对微生物的杀灭作用，消毒试验中要求选择适当中和剂所选中和剂不仅能及时中止消毒剂的杀微生物作用，且中和剂本身及其与消毒剂的反应产物(下称中和产物)尚需对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基无不良影响A2培养基和试剂A2.1营养琼脂培养基成分： 蛋白胨 10g 牛肉膏 3g 氯化钠 5g 琼脂 15g-20g 蒸馏水 1000mL制法：除琼脂外，其他成分溶解于蒸馏水中，调pH至7.2-7.4，加入琼脂后加热溶解，过滤分装，经121℃、压力蒸汽作用30min，灭菌后备用A2.20.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2～7.6，下称PBS)。

成分：磷酸氢二钠　　2.84g磷酸二氢钾1.36g蒸馏水1000.00mL　　制法：将磷酸氢二钠与磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中，pH为7.2～7.4，分装，经121℃、30min压力蒸汽灭菌后备用A3器材A3.1锥形烧瓶A3.2平皿(直径9cm)A3.3量筒A3.4精密pH试纸A3.5无菌试管A3.6无菌刻度吸管(1.0，5.0，10.0mL)A3.7恒温培养箱A3.8冰箱A3.9菌落计数器A3.10酒精灯A4中和剂(注明生产厂家，批号)A5操作方法A5.1用PBS将指示菌制成5×105～5×106cfu/mL悬液A5.2将消毒剂用灭菌蒸馏水配制成3种不同浓度，在不加中和剂的情况下，测知该消毒剂10min抑杀指示菌99.9%以上的最低有效浓度A5.3取消毒剂10min抑杀指示菌的最低有效浓度与待选择中和剂进行试验，选出中和剂种类并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度，选出试验浓度的消毒剂使用中和剂的浓度A5.4中和剂选择试验时，先将消毒剂1.0mL与中和剂溶液9.0mL混合，制成中和产物溶液，再按表A1分组进行表A1中和剂选择试验组号0.5mL菌液加于：混匀作用10min取0.5mL混匀液加入：（加入后总量为5mL）作用10min后，取原液或稀释液0.5mL接种平板（2个/样本）：1消毒剂4.5mLPBS 4.5mL原液，×102消毒剂4.5mL中和剂4.5mL原液，×103中和产物4.5mLPBS 4.5mL×100，×10004PBS 4.5mLPBS 4.5mL×100，×10005中和剂4.5mLPBS 4.5mL×100，×10006PBS 5.0mL原液 然后，倾注平板置37℃培养48h，计数菌落数，按稀释倍数计算出回收菌数（cfu/mL）。

A6中和试验结果报告方法(如表A2)表A2中和试验结果举例中和剂各组回收菌落数，cfu/mL3、4、5组间误差率，%1234561%卵磷脂07084.67×1064.83×1064.11×10606.271%卵磷脂+0.1%吐温8007945.81×1065.89×1065.78×10600.721%吐温8001943.31×1065.31×1065.21×106018.170.5%硫代硫酸钠01323.20×1065.03×1065.18×106018.94　3、4、5组间误差率计算公式误差率（%）=[（∣三组均数-3组菌数∣+∣三组均数-4组菌数∣+∣三组均数-5组菌数∣）/ （3×三组均数）]×100A7判定标准A7.13、4、5组菌数相似，其误差率≤10%A7.26组无菌生长A7.32组菌数明显少于3、4、5组A7.41组不长菌或明显少于2组　　符合上述标准的中和剂表明可消除消毒剂对指示菌的作用，中和剂及其与消毒剂的中和产物对指示菌无毒害，判定为该消毒剂的中和剂A8消毒试验用中和剂浓度的选择按A5.4步骤进行，按A7.1～7.4的标准判定附录B消毒剂定性消毒试验(补充件)B1内容提要定性消毒试验是测定受消毒。