渔用细菌菌蜕疫苗的研究进展.docx

王荣华谭情刘佩张胜金戈刘小燕(湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128)细偏偏蜕是通过向宿E帽引入外源性裂解基因，并调控R表达而形成的无细胞浆和繁殖能力的细菌空壳，是种新型疫苗的研制策略，同时也是一种药物和活性物质的递送系统.1985年LubitZ等人对率先使用大肠杆陶噬的体Phix174的裂解E基因制备大肠杆萌菌蜕,此后,细情菌蜕的工艺在哺乳动物、鱼类等的致病惆疫苗研究中得到r大危运用•一、菌蜕的形成和制备在■菌体PhiX174怫染革兰氏阴性菌的过程中,原因E表达的蛋白4裂解过程中起上导作用因而，粘因E被确认为裂解基因，共编码的膜蛋白含91个敏基酸，分了虻约为10500,该蛋白能够融合革兰氏阴基金项目：湖南省科技厅项目(2013NK3031).占肝脏“完全溶化”：用匆组病仇康发，大红鳄的症状基本消失，值体相对正常四、异育根细“鲤出血”苏北是我国淡水芥殖的大区，养殖面枳可达儿百万面，上要弄殖对象为异育银鲫等，近年来异育银鲫的鳄出血病一直是养殖户M头痛的华情，被称为“不治之症”，IL不能随意用药，•些传统消毒剂由于本分有定的刺激性，在发生鳄出血时用这些约物反而会刺激鱼死亡ht激增，该病给、，地水产养殖业造成了U大的经济损失。

其上荽症状为病伯.鳄部出血，身体泛红，内脏充血或出血.发病时水温-般在18〜25C,若不在该温度区间时也有可能发病今年该病来势凶猛，4一7月，在大丰、东台、射阳等地区均有该病发生，发病龟燃格不等.每个发病塘口均采用相同的试验方法,在60升水箱每次加入1.5宅克/升的聚六亚甲基膈处理折鱼,与对照组及不同发病塘口比较发现:聚六亚甲基阪对异育银鲫鲍出血病仃•定的治疗效果，IL该效果与发病时间有一定关系,病程越短,治疗效果越好，且用药景小;病程较长时,用了3次1.5%克/升的聚六亚甲堪瓢可能都没法取得理想的效果・'与询研究己确定，该病由鲜抱疹病毒II型(S-rinidherpesvirus11，CyHV-2)引起,属于病毒性疾利纵观人、布、肉、油，这些行业中病毒性疾病最性雀的内外细胞膜,并使菌膜形成个直径在40〜200纳米的特异性跨膜通道,使得细|有内的渗透所高于环境，在渗透压的作用下，细胞内容物经由裂解通道排出，从而形成不含核酸、核糖体及其他鲍分的细尚空壳目询通常将特异性跄膜通道的形成过程分为三个阶段：第-阶段裂解基因E诱导表达后，蛋白E整合进入细胞内膜,并使其C端朝向细胞质面;第1阶段位于E蚩白的第个嵌膜蛋白a-螺旋结构内第21位肺氛酸残基发生的顺反异构化，使E蛋白骸介进入外膜，E蛋白改变C端朝向.穿出内膜.同时多个E蛋白形成堪聚体，从而启动裂解：在第三阶段蛋HE的C端朝向细陶外膜，使得内外膜在局部融合，膜电为糠F，即使最进步的人类医疗业业对人类-些病毒性疾病也束『无策.IL人类病毒性疾病多以SE射疲萌的形式预防为主.所以芥殖户应该仃此意识，病面性疾病要靠预防，而不能亢全指望依锥某种约物的治疗效果。

聚六亚甲基IK在众多药物中脱颖而出,对异育银鲫鳄出血病有一定的治疗效果，说明该约对引起鳄出血的病毒有一定的抑杀作用，此约物可用「预防勰出血病的发生五、总结聚六亚甲基昵对水产养花水体中的有'害微生物仃很强的抑杀作用，能有效抑制水中细菌、病毒、真菌的滋生和繁衍，防止色、虾等水生动物因养殖水体中存在的细偶、病毒等病原体感染，能仃效促进水产动物健康和快速生K2014.11如今水产养殖业种质茬、鱼体弱、怪病多、约物杂，致使发病水产动物不能受约物刺激，•歧疾病无药可治，养殖户对水产养殖业日渐失去信心较传统消毒剂,聚六亚甲基IM具有无莓、无刺激、性质稳定等优点，应有艮好的推广应用询筮，面对尚无仃效治疗约物H.给水产养殖造成重创与E大经济损失的各类“疑难杂症”，聚六亚甲基脓的治疗效果算是异军突起，可以给对养殖逐渐失去信心的养殖者带来希望和信心，对推进水产养殖病出防控和科学用药业仃-定的指导意义位崩溃，形成跨膜孔道细菌曲蜕生产成功的关键是严格调控E基因的表达，PhiX174的裂解基因E可以受控于多个表达系统，如pL/PR-cI857、LaepO-Laelq或tol等，其中以pL/pR-cl857最为常见。

在XpL/pR-cI857系统中，当温度低F30C时，阻遇蛋白C1857的表达能使基因E被抑制,而当高于30C时，阻遇蛋白CI857因热失活，基因E开始表达；当温度为42C时，阻遇蛋白CI857活性最低.细菌裂解达到最佳状态由于许多革兰氏阴性菌在低于30C生K缓慢，同时在温度由30C迅速升高到42C时，会损坏细萌表面的抗原决定魏结构，影响免疫效果，因此提高载体系统的热稳定性，将何利于菌蜕的生产有研究发现在XpR-cI857系统中通过基因定点突变技术引入双突变，将大大提高XpR-c【857系统的热稳定性；当温度不高于37C时，突变后的XpL/pR-cL857系统仍能稳定地抑制基因E表达，而当温度达到39〜42C时，阻遇蚩白CI857失活解除抑制，开始诱导细南裂解二、细菌菌蜕疫苗在水产上的应用在水产养殖E,H前对细曲性疾病的预防和治疗主要依赖亍化学约物和抗生素，由「抗生素等药物的K期使用带来的多眼耐药性，药物残留和在环境中的扩散已经引起了食品安全和环境公共卫生方面的密切关注随若生物技术的发展，使用疫苗进行水产养殖病害防治己被证明是一种安全、经济、高效的措施鱼类作为低等脊椎动物，已经具有专门的免疫器官(胸腺、头肾和脾等)和初步的特异性免疫防御机制，接种疫苗可诱导负体产生免疫应答反应，从而可以提高鱼体的免投力，抵抗病原菌的攻击，达到预防疾病的目的。

俯蜕疫苗作为-种高效安全的新型疫苗，得到了广大水产研究者的关注,迟缓爱德华氏菌菌蜕、嗜水气单胞的他蜕、柱状黄杆慎菌蜕、鳗抓馆菌蜕等菌蜕疫苗相继有报道,并『L取得了良好的免疫效果I. 迟缓爱德华氏菌菌蜕迟缓爱德华氏菌｛Edwardsidlatarda)是水产养殖业常见的病原曲，同时该菌还是一种重要的人、兽共患病的病原，可引起人的脑膜炎、肝脓肿、蜂窝组织炎、骨精炎和败血症等迟缓爱德华氏询感染范围很广，在海水、淡水养殖动物中普遍流行，大菱鲜、牙鲜、鳗鱼、胭脂鱼、大马哈鱼、耨鱼、鲫色、罗非鱼、绘鱼和黄鳍等都能感染而发病，能够导致不同年龄的鱼类大量死亡，对水产养殖业造成严重危害，严重阻碍水产养殖业的健康发展王雪鹏利用噬曲体Phixl74的裂解基因E构建了迟缓爱德华氏圜溶菌质粒pLysisE,并成功转化进退缓爱德华氏菌，在42C诱导8小时制备了迟缓爱德华氏菌I埼蜕疫苗(Edwardsiellatardaghost,ETG),并用ETG和福尔马林灭活疫苗FKC同时通过灌肖方法免疫小鼠，ETG组小鼠血清IgA和IgG的抗体效价、外周血淋巴细胞中CD3+/CD4+/CD8+阳性的白分率都显著高于FKC和PBS对照组，攻毒后，ETG组小鼠获得了更强的免疫保护率；使用ETG和FKC腹腔注射免疫斑马鱼后，ETG免疫组的白细胞芥噬活性明显高FFKC组，旦ETG的免疫保护率高达83.3%,显著高于FKC组。

因此，ETG疫苗能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫，提高免疫保护率，比全菌福尔马林灭活疫苗能更有效地激活机体的免疫保护反应2. 嗜水气单胞菌菌说嗜水气单胞慎在自然界中分布广泛，是动物及人类疾病的原发性或继发性致病佑，由嗜水气单胞菌弓I起的疾病在鱼•类养殖中也普遍存在，给生产养殖带来了巨大的经济损失付立雀通过将噬菌体Phixl74裂解基因E及其控制单元整合进嗜水气单胞菌染色体的aroA基因内，构建出兼只减本特性的菌蜕疫苗(Aeromonashydrophilaghost,AHG)»腹腔注射免疫异育银鲫后，AHG免疫组血清凝集效价、杀削活性均显著高于福尔马林灭活组，同源菌攻击试验显示，AHG、福尔马林灭活组和PBS对照蛆的存活率分为90%、65$和15%研究结果显示，AHG疫苗能诱导更为强烈的免疫反应，提高免疫保护能力3. 柱状黄杆菌菌坑柱状黄杆(Flavobacteriumcolumnarc)是柱形病(columnarisdisease,CD)的致病菌,能引起经济鱼类感染而发病，且死亡率很高，给全球水产养殖业带来巨大经济损失祝文兴成功构建了PBV-geneE-Fpro-cat、pET28a-geneE-cat与pET32a~geneE-cat•:种质粒，并将pET32a-geneE-cat转化入柱状黄杆曲强毒株F.columnar。

G4R3,成功构建柱状黄杆菌菌蜕(Flavobacteriumcolumnareghost.FCG),使用FCG利福尔马林灭活疫苗腹腔注射免疫健康革鱼，草鱼的血清凝集效价和血消杀菌活性均显著升高，攻毒后，FCG组草值获得了70.9%的相对免疫保护率，显著高于福尔马林灭活疫苗组，这些结果表明腹腔注射FCG能诱导体液和黏膜获得性免疫反应，且能诱导强的获得性免疫保护，提示FCG有•望成为在临床上防治柱状黄杆弱感染的一种安全、高效、经济的新型候选疫苗随着社会经济的发展，现代高科技和工艺使得活体生物的养殖、展示几乎没有限制，从深海的生物到体重数吨的鲸鲨均以前所未有的形式出现在社会大众面前观赏性水母以其轻盈孰逸的外形、艳丽的色彩、神秘的海洋气息受到越来越多的关注在居室、会所、宾馆放置观赏性水母已经成为一种时尚、品位的象征在观赏性水母的养殖过程中，常会出现各种原因引起的疾病，给人们经济氏至情感上带来损失本文对观赏性水母的常见疾病进行初步研究，并对其影响因素进行分析，为观赏性水母的养殖、开发利用提供参考一、观赏性水母的常见疾病1. 伞状体发白、穿孔水母金状体出现斑块状发白，随恭养殖时间的加发白的面积不断扩大，严重时伞状体发生穿孔，大面积溃烂，影响水母的观赏，甚至引起水母的死亡。

2. 伞状体翻转水母的伞状体发生翻转，严重影响水母的观赏随者养殖时间的加长，翻转程度逐渐加剧，并伴随伞状体的萎缩发生会状体翻转的水母正常进食，伞状体的萎缩最终导致水母死亡3. 伞状体球状突出水母的伞状体中间形成一个球状的突出，发生隆起随着养殖时间的加长，降起程度会缓慢加剧，但并不影响水母的日常游动、进食等，对水母的观赏价值产生影响4. 侧翻、无法平衡水母在水体中无法保持正常三、展望萌蜕的概念自1985年提出至今己近30年，其应用对象己不再局限于大肠杆菌，许多其他革兰氏阴性菌如迟缓爱德华慵、嗜水气单胞菌、柱状黄杆菌、豚鼠1单胞菌、鳗弧曲等有关文章相继报道了这些细菌菌蜕的构建，动物免疫试验中也证实了菌蜕的免疫效果优于传统疫苗但任何事物都不可能非常完美，菌蜕疫苗也存在需改进的地方和度好的发展空间现今菌蜕制备使用的温控表达系统在其窝主菌大肠杆简内能很好地发挥作用，但对其他一些革兰氏阴性细菌如沙门氏菌、迟缓爱德华氏菌和簸弧菌等的作用效率却要低很多，然而目前对筛选出的表达系统，能否提高对革兰氏阴性曲的裂解效率未见报道；此外，目前没有对不同动物应选择何种免疫途径以及免游泳姿势，发生侧翻、无法平衡若处理不及时易形成空泡，影响水母的规'我性。

5. 触腕打结水母长长的触腕是观赏的一部分,在养殖翻内，K长的触腕常会发生相互缠绕，通常情况F水母可自行解开缠绕缠绕严咆时产生触腕打结，造成触腕的断裂，影响水母的运动、观赏6. 伞状体扁平，游泳能力差水母余状体部分扁平，触腕收缩无力，游动能力差，影响水母的运动、观赏二、治疗及预防水母是一种低等的无脊椎生物，对水母的疾病须坚持“预防为主、治疗为辅"的方针I」常养殖中须仔细观察水母的游动状态、伞状体收缩情况、水母表面的完整情况等，及早发现问题，并进行针对性的治疗在条件允许的情况下将养殖缸内的水"捞出隔离进行单独治疗，效果更为明显1.伞状体发白、穿孔选取水母白化部位的组织，使用水浸片法进行显微镜检查，压片时确保没有气泡，观察的组织不宜太厚经过显微镜观察，在其。