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Western Blot蛋白提取与样品制备 >>>>Western Blot第一步便是样品制备,但是在开始制备样品之前,实验者应该对自己的实 验有一个非常清楚的思路,通常需要思考的最根本问题包括： 要检测的靶蛋白是否存在该样品中？靶蛋白的含量是否在 Western Blot的检测下限以上〔目前认为 Western Blot的有效检测下限为0.1-1 ng〕 ?要检测的靶蛋白在组织或细胞的哪个时期存在？是否需要特殊刺激才会 表达？是否只有在病变组织中才会有表达？是否存在多种异构体？是否容易发生自行降 解？靶蛋白分子量是不是非常大或者非常小？靶蛋白是否仅存在特殊的细胞器中而需要分 离出细胞器？充分思考了这些问题才有可能对样品制备有一个比拟完善的策略.蛋白提取可以分为三个步骤：第一步获取材料,第二步别离目的细胞或组织成份并破碎, 第三步就是进行裂解制样.这里就这三个步骤展开一一讨论.材料的获取 从大方向讲,Western Blot的对象可以是植物组织、动物组织和培养物.植物组织的获取一般应该不是很困难, 尤其是可进行人工种植的植物更是方便. 动物组织的获取就相对困难许多, 一是要考虑到法律上的问题, 二是需要实验者有丰富的解剖经验, 可以快速准确地从动物体上取下需要的组织或 Organ〔要和谐,下同〕.培养物就不用多说了,几乎每个实验者都养过细菌或者细胞的. 如果是动物组织或者植物组织, 一般情况下都可以用手术刀和手术剪从个体上分下需要的部份. 如果是细菌,那么可以将养好的菌液收集起来离心,然后弃去上清即可, 如有必要,可以再用等渗中性溶液洗涤数次. 如果材料是培养的细胞,建议将细胞从培养瓶〔皿、板〕内刮下来再离心处理,也可以不收集采取而直接在培养 容器中裂解,详见下文.非常不建议用酶将细胞从培养器皿上消化下来再进行裂解. 在组织或者细胞进行裂解之前,一般都要将组织或者细胞清洗干净〔对于组织可用预冷的等渗 buffer洗涤,对于细胞也用等渗 buffer洗涤再用离心法去掉洗涤液即可〕,以除去组织中的污垢、血液和细胞培养中的培养基以及添加物.细胞破碎如果收集到的材料是组织或者 Organ,第一步往往是将它们分切成小块方便操作.接下来就是准备进行细胞破碎了. 细胞破碎的方法分为机械法和非机械法, 机械法可以是振动、搅拌、研磨、压滤、超声、匀浆,非机械法可以是枯燥、改变渗透压、冻融、酶 解〔纤维素酶、溶菌菌、蜗牛酶〕等,不同来源的材料对于不同的处理方法耐受程度是不一 样的,例如超声波可以很容易破碎动物细胞, 但是破碎酵母细胞就困难许多. 在这里有三个问题需要指出：〔1〕所有的操作尽量在低温条件下进行,预防细胞内的蛋白酶释放出来而 将目的蛋白降解,最好全程都在冰浴中进行,有条件用液氮的就用液氮,下同.〔 2〕超声处理中会释放出大量的热, 因此一定需要冰浴. 同时超声过程会释放自由基, 有可能改变蛋白质的结构,可向系统中参加少量的 GSH 〔谷胱甘肽〕进行复原.另外,超声过程有可能打断蛋白质大分子,所以如果研究的蛋白质分子量比拟大时建议减少超声处理时间或者换用 其它方法处理.〔3〕如果使用蛋白酶处理,可能会将目的蛋白降解,同时还引入了新的蛋 白质从而干扰实验, 所以一般不推荐使用. 细胞的破碎与裂解过程没有严格的时间和空间界线,其作用仅仅是为了使裂解过程更容易,因此在破碎细胞过程中所用的 Buffer 一般也是裂解时的裂解液,注意不能加太多,根据经验,一般每克组织加 2-3ml裂解液为宜.杂质的去除 除了前面获取材料时提到的组织中的污垢、 血液和细胞培养中的培养基以及添加物这些杂质外,附在组织上的油脂、细胞外层的细胞壁、细胞内部的长链 DNA等都会干扰 Western Blot中的SDS-PAGE —步,因此有必须除去. 对于油脂,一般可以直接离心除去〔一般以10000g离心10min油脂都会漂浮在最上层,吸走即可〕,也可以利用 SiO?将其吸附而离心除去〔10000g, 10min,油脂在下层〕.对于细胞壁,一般在裂解液中的溶 解比拟差,待裂解完直接离心除去即可.对于长链DNA,可用链霉素使之沉淀再离心除去, 也可以用超声波处理将其打断变成小片段 DNA,就不会干扰SDS-PAGE而不用从体系中除掉.蛋白质的提取 蛋白质的提取过程,简言之就是使细胞内的靶蛋白尽可能都溶解于液相而方便进行电泳,其核心思想就是根据靶蛋白的特性, 选择适宜的助溶剂和保护剂. 这一部份涉及到的内容比拟多,我就一步一步地讨论.〔1〕蛋白质的分类 蛋白质的分类方法比拟多, 可以根据功能分类、 可以根据在细胞中的 定位分类、可以根据溶解性分类、可以根据三维结构分类. 这里只提按溶解性和在细胞中的定位分类法,这两种分类对理解蛋白质的提取极有帮助. 根据溶解特性分类,蛋白质的分类情况如下：〔参阅王镜岩版生物化学〕种类举 例溶解特性清蛋白血清白蛋白、卵清蛋白溶于水和中性盐溶液,不溶于饱和硫酸铵溶液球蛋白免疫球蛋白、肌球蛋白不溶于水,溶于稀中性盐溶液,不溶于半饱和硫酸铵溶液谷蛋白米谷蛋白不溶于水、中性盐及醇,溶于稀酸、稀碱醇溶谷蛋白小麦醇溶谷蛋白不溶于水、中性盐溶液,溶于 70-80%乙醇中硬蛋白角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白不溶于水、稀中性盐、稀酸、稀碱和一般有机溶剂组蛋白胸腺组蛋白溶于水、稀酸、稀碱、不溶于稀氨水精蛋白鱼精蛋白溶于水,稀酸,稀碱、稀氨水了解了蛋白质的溶解特性, 就可以考虑用适宜的试剂将蛋白质溶解或者将高丰度的蛋白质 从体系中除去.根据蛋白质在细胞中的定位, 笼统上讲可以分为三类： 膜蛋白、胞浆蛋白〔包括内膜系统蛋白〕和核蛋白.其中膜蛋白的结构相对来说比拟复杂,是蛋白质提取中挑战最大的一类； 胞浆蛋白那么都比拟容易提取, 它们大多数可以直接溶于生理盐溶液中； 核蛋白那么往往容易形成复合体或与核酸结合在一起, 同时组蛋白还含有大量带正电的组氨酸而在电泳过程中可能 出现电泳速度和预计分子量不符的情况.(2) 蛋白质的稳定 自从细胞破裂后,很多蛋白质就变得不稳定起来,其中一些蛋白质会发生自行降解,另外一些蛋白质可能在从细胞内释放出来的蛋白酶的作用下而被水解, 还有一些在机械剪切力的作用下发生断裂. 于是不难理解在进行蛋白质提取过程中有这么几个因素需要注意：轻柔、低温、加蛋白本酶抑制剂.轻柔操作这个就不多说了, 动作小心点就是,低温操作前面也讲到过,全程冰上进行是最好的,下面重点说说蛋白酶抑制剂.首先先来了 解一下蛋白酶.蛋白酶依据其活性中央, 可以分为这么几类： 丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、苏氨酸蛋白酶(罕见).另外对于磷酸化 Western blot的实验,还要考虑磷酸酶.对于上述不同的蛋白酶目前几乎都有有效的抑制剂, 在提蛋白过程中参加这些蛋白酶抑制剂可以极有效地预防靶蛋白被内源性的蛋白酶降解. 常用的蛋白酶抑制剂有以下几种：丝氨酸蛋白酶抑制剂： PMSF,AEBSF-HCI ,Aprotinin,Chymostatin,亮肽素(Leupeptin)天冬氨酸蛋白酶：PMSF,碘乙酸、抑肽素(Pepstatin),云芝发酵物巯基蛋白酶抑制剂： PMSF,TLCK,TPCK,Antipain-HCI,N-乙基顺丁烯二酰亚胺金属蛋白酶抑制剂(金属离子螯合剂)： EDTA,EGTA,塔罗肽苏氨酸蛋白酶：目前缺乏资料磷酸酶抑制剂：NaF,激活的原矶酸钠(激活方法将在试剂档案提及)、焦磷酸钠、 &甘油磷酸钠.各种蛋白酶抑制剂的使用方法和浓度范围将在本站试剂档案栏目中提及, 如果您觉得这些试剂购置和配制麻烦,也可以买商品化的鸡尾酒系列( cocktail),它们一般包括了大部份的蛋白酶抑制剂种类,使用起来也极为方便.(3) 蛋白质裂解液的选择 对于水溶性的蛋白质提取一般来说都非常简单,只需要将细胞充分破碎将其释放出来即可, 但是对于一些膜蛋白、 包涵体等难溶的蛋白必须采用助溶剂溶解.常用的助溶剂有这么几种：盐酸胍、尿素、硫脲、稀酸、稀碱、去垢剂(又叫外表活性 剂或去污剂).需要注意的是用这些方法助溶的蛋白质被经过快速稀释的时候依然可能出现 沉淀,尤其在跑胶上样的时候, 已经溶解的蛋白质仍然可能变成不溶解的状态, 因此使用时建议初步裂解后将初步裂解的样本离心处理, 然后再向不溶成份中参加这些助溶剂, 然后再用离心得到的上清缓慢稀释预防再次沉淀. 另外,盐酸胍溶解的样品跑胶时很出现沉淀, 慎用；用稀酸溶解的样品不能进行跑胶,因此可能只能作为一种除去非目标蛋白的参考手段. 这里重点提一下去垢剂, 在所有助溶剂里去垢剂是最有效的, 而且较低的浓度就可以起到很明显的效果.所有的去垢剂都由两部份组成, 一部份是亲水的,一部份是疏水的, 在助溶蛋白质的过程中,去垢剂的疏水基团一般主要和蛋白质结合, 亲水基的一端那么倾向于溶解在水中.溶于水后能解离成离子的去垢剂叫离子型去垢剂, 否那么叫非离子型去垢剂, 离子型去垢剂根据水中生成的离子类型又可以分为阳离子型去垢剂、阴离子去垢剂和两性离子去垢剂, 近年来还创造了含离子型亲水基又有非离子型亲水基的混合型去垢剂. 在这五种类型的去垢剂中,混合型垢剂垢一般不常用,而阳离子型去垢剂不可以用于 SDS-PAGE(由于它们会使蛋白质带上正电荷,电泳习性和 SDS-PAGE原理相前背〕,所以实际上用于蛋白质提取的去垢剂只有阴离子去垢剂、两性离子去垢剂和非离子型去垢剂,它们的代表试剂如下：阴离子去垢剂：SDS 〔十二烷基磺酸钠〕、 DOC 〔脱氧胆酸钠〕、SLS 〔十二烷基肌氨酸钠〕两性离子去垢剂：CHAPS,Zwittergent系列非离子型去垢剂： Triton X-100,Triton X-114,Tween-20 ,NP40, C8APG 〔辛基葡萄糖 苷〕。