质粒抽提的技术方案.doc

主要溶液配制:1LB液体细菌培养基:蛋白陈10g,酵母提取粉5g,氯化钠10g,加水至IL, NaOH调pH至7.4,分装，高压蒸汽灭20min.2 LB固体细菌培养基:100ml的LB液体细菌培养基中加入1.59琼脂粉，分装，高压蒸汽灭菌20min,冷却至5(TC,加入抗生素(卡那霉素终浓 度为50pg/ml,氨节青霉素终浓度为100pg/ml)9平铺90mm直径培养皿3 50xTAE缓冲液(IL):Tris碱242g,冰醋酸57.1ml,o.5mmol/LEDTA(Ph8.0)100ml,$容至 IL,密闭保存”4 0.1M的CaC12:称取1.119无水氯化钙,定容至100ml,0.22pm孔径的无菌滤器过滤,4P密闭保存”5质粒抽提用溶液I:含50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris碱 (pH8.0), 1 Ommol/LEDTA(pH8.0),成批配制，每瓶100ml,高压蒸汽灭菌15min 6质粒抽提用溶液II:配制0.4mol/Na0H,2%SDS溶液，用前根据需要量在容器内加入一半0.4mol/L NaOH, 一半2%SDS溶液，终浓度为0.2mol/NaOH, 1%SDS 溶液；7质粒抽提用溶液111:1 OOmL中含60ml 50mol/L乙酸钾,11.5ml冰乙28.5ml双蒸水8 30%丙烯猷胺:29g丙烯猷胺和1 g N,N.一亚甲双丙烯猷胺溶于100ml 双蒸水中，过滤备用”9Tris-HCI(pH8.8):18.2gTris 碱和 0.49SDS 溶于 10oml 双蒸水中，浓盐 酸调节pH10Tris-HCI(pH6.8): 6.05gTris 碱和 0.4gSDS 溶于 100ml 双蒸水中，浓 盐酸调节pH”11 5xTris-甘氨酸电泳缓冲液:15.lgTris碱和94g甘氨酸溶于950ml 双蒸水中，再加入50ml 10%的SDS贮存液12 lmol/L 二硫苏糖醇(DTT):20ml 0.01 mol/L 乙醇钠溶液(Ph8.2)溶解 3.09gDTT,过滤后分装贮存于-2(TC13 2XSDS-PAGE 上样缓冲液:100mmol/LTris-HCI(pH6.8),200mmol/L 二硫苏糖醇(DTT),4%SDS02%澳酚蓝;20%甘油14 10%SDS贮存液(pH7.2): 1000ml双蒸水中溶解100g电泳级的SDS,加热至68C助溶，浓盐酸调节pH15 10%过硫酸胺:lg过硫酸按溶解于10ml双蒸水中,-20。

3保存16考马斯亮蓝R-250染液:90ml甲醇:水(1:1,V/V),和10ml冰醋酸混合液，加入考马斯亮蓝R-250 0.25g,充分溶解过滤备用17脱色液:10%乙酸,30%甲醇,60%双蒸水18转膜液:Tris5.5g,甘氨酸2.9g和0,37gSDS溶于800ml双蒸水中，再 加入200ml甲醇”19 1OXTBS(pH7.4):80gNaCI,2gKCI 和 30gTris 溶解于 1000ml 双蒸水中，浓盐酸调节pH20 TBS/T:将lOxTBS稀释10倍后以1/1000的比例加入吐温-20即可小鼠GITRL基因重组腺病毒表达载体的构建1 pAdTrack-CMV载体的酶切将pAdTrack-CMV载体用Bgl n , SazI双酶切后胶回收,在0.2 ml PCR管中加入下列组分后充分混匀:Volume ( pl )26112820Components1 OxReactionBufferHP Ad Track-CMV PlasmidBginSazIRNAasddH2OTotal volume37条件下，酶切3-4h,上述酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶上 进行电泳,在紫外灯观察，并用刀片切下目的条带，置于1.5ml 离心管中，采用QIAGEN公司的胶回收纯化试剂盒，步骤如下: 每 10mg 胶加入 10pl Membrane Binding Buffer,55C-65C水 浴至胶完全熔化后加入离心柱中，室温放置Imin, 16000g离心 1 min,弃去流出液，加入 700pl Membrane Wash Buffer, 16000g 离心 Imin,再加入 500pl Membrane Wash Buffer, 16000g离心5min,此时将离心柱放入另一离心管中,待膜干 燥后加入30pl无核酸蒸憎水，室温放置1 min, 16000g离心 1 min,流出液即为纯化的开环P Ad Track-CMV质粒片段.2目的基因的纯化将GTTRL-PMD18T载体上的目的基因GTTRL用Bgl H ,SazI双酶切后胶回收。

Components在0.2 ml PCR管中加入下列组分后充分混匀:Volume ( pl )1 OxReactionBuffer H2GITRL-PMD18T Plasmid10Bgin1SazI1RNAas2ddH2O4Total volume20驱37P条件下，酶切3-4h,上述酶切产物在1.0%的琼脂糖凝胶上 进行电泳,在紫外灯观察，并用刀片切下目的条带，置于1.5ml 离心管中，采用QIAGEN公司的胶回收纯化试剂盒,步骤同 上3目的基因与pAdTrack-CMV载体的连接。