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杂交瘤技术制备单克隆抗体.ppt

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  • 文档编号:574000057
  • 上传时间:2024-08-15
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    • 杂交瘤技术制备单克隆抗体杂交瘤技术制备单克隆抗体抗体部员工培训之抗体部员工培训之—— 单克隆抗体(单克隆抗体(McAbMcAb):):是由只识别单一抗原决定簇的是由只识别单一抗原决定簇的B B细胞克隆产生的同源抗体细胞克隆产生的同源抗体 理化性状高度均一理化性状高度均一效价高效价高只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一只与一种抗原表位发生反应、生物活性单一具有高度特异性又易于大量制备具有高度特异性又易于大量制备 如何获得如何获得McAb?McAb?如何大量获得如何大量获得McAb?McAb?需要克服哪些技术问题?需要克服哪些技术问题? 理想的抗体分泌细胞:理想的抗体分泌细胞: 具有合成和分泌抗体的能力具有合成和分泌抗体的能力 具有大量无限生长的特性具有大量无限生长的特性       在在1975年,年,Kohler 和和Milstein将来源于小鼠骨髓的将来源于小鼠骨髓的骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞和啮齿动物可以和啮齿动物可以分泌抗体的细胞分泌抗体的细胞融合后形成杂交瘤细胞,该杂交瘤融合后形成杂交瘤细胞,该杂交瘤细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力,也具有免疫细胞分泌抗体的能细胞具有肿瘤细胞无限繁殖的能力,也具有免疫细胞分泌抗体的能力,后来将这种杂交细胞系统统称为力,后来将这种杂交细胞系统统称为杂交瘤杂交瘤((hybridoma)。

              通过筛选,分离得到针对通过筛选,分离得到针对特异性抗原特异性抗原并具有所要求的抗体亲和并具有所要求的抗体亲和力的力的杂交瘤细胞杂交瘤细胞在适当营养条件下,杂交瘤细胞能够在适当营养条件下,杂交瘤细胞能够生长和无限生长和无限制性传代制性传代,并且能产生,并且能产生大量单一类型的抗体大量单一类型的抗体及单克隆抗体及单克隆抗体 一、杂交瘤技术的基本原理一、杂交瘤技术的基本原理二、单克隆抗体的制备二、单克隆抗体的制备三、单克隆抗体的应用三、单克隆抗体的应用  一一 杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的基本原理 利用利用聚乙二醇聚乙二醇作作为细胞融合胞融合剂,使免疫的,使免疫的小鼠脾小鼠脾细 胞胞与具有与具有在体外不断繁殖能力的在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤小鼠骨髓瘤细胞胞融融为一一 体,在体,在HATHAT选择性性培养基培养基的作用下,只的作用下,只让融合成功的融合成功的杂交瘤交瘤细胞生胞生长,,经过反复的反复的免疫学免疫学检测筛选和和单个个细胞培养(克隆化)胞培养(克隆化), ,最最终获得既能得既能产生生所需所需单克隆抗体克隆抗体, ,又能不断繁殖的又能不断繁殖的杂交瘤交瘤 细胞系胞系,将,将这种种细胞胞扩大培养,接种于小鼠腹腔,在其大培养,接种于小鼠腹腔,在其产生的腹水中即可得到高效价的生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体克隆抗体。

      流流程程杂交瘤技术杂交瘤技术 1.颗粒性抗原颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果免疫性较强,不加佐剂就可获得很好的免疫效果 2.可溶性抗原可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,免疫原性弱,一般要加佐剂,可溶性抗原可溶性抗原10-50ug/100ul+等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔,等量弗氏完全佐剂注射小鼠腹腔, 2-4周后加强免疫(量减半,改用不完全佐剂,可反复多次)周后加强免疫(量减半,改用不完全佐剂,可反复多次)冲击免疫(融合前冲击免疫(融合前3天进行)天进行)选用选用6-12周龄周龄Balb/c小鼠 小鼠 免疫方案免疫方案 不产生不产生IgIg的重链和轻链的重链和轻链HGPRT-与提供淋巴细胞的动物品系相同与提供淋巴细胞的动物品系相同小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞 处于免疫状态脾脏中的处于免疫状态脾脏中的B B淋淋巴母细胞或浆母细胞巴母细胞或浆母细胞动动 物:物:6 6~~1212周龄周龄20g20g~~25g25g体重体重免疫脾细胞免疫脾细胞 细胞融合剂:细胞融合剂:PEG:分子量分子量4000 的的PEG是最常用的细胞融合剂是最常用的细胞融合剂作用机理:作用机理:诱导细胞膜上脂类物质结构重排,使细胞诱导细胞膜上脂类物质结构重排,使细胞膜易打开而有助于细胞融合膜易打开而有助于细胞融合作用特点:作用特点:不同的分子质量、浓度、作用时间、不同的分子质量、浓度、作用时间、pH,可可能直接影响融合效果能直接影响融合效果细胞融合细胞融合 培养骨髓瘤细胞:培养骨髓瘤细胞:对数生长期对数生长期浑圆、透亮、均一、排列整齐浑圆、透亮、均一、排列整齐避免细胞返祖:定期用避免细胞返祖:定期用8-AG8-AG处理细胞处理细胞1-21-2××10107 7免疫脾细胞的制备:免疫脾细胞的制备:1-21-2××10108 8 无菌手术无菌手术 饲养细胞:饲养细胞:常用小鼠腹腔巨噬细胞,常用小鼠腹腔巨噬细胞,5-85-8××10106 6分泌细胞生长因子分泌细胞生长因子吞噬衰老细胞和微生物吞噬衰老细胞和微生物存活一般不超存活一般不超2 2周,不影响杂交瘤细胞的纯化周,不影响杂交瘤细胞的纯化 杂交瘤细胞的选择性培养杂交瘤细胞的选择性培养细胞细胞DNA合成途经:合成途经:1.1.替代途径:次黄嘌呤(替代途径:次黄嘌呤(H H)) HGPRTHGPRT2.2.主要途径:主要途径:氨基酸氨基酸 鸟嘌呤核苷鸟嘌呤核苷酸酸谷氨酰胺谷氨酰胺 ((A-A-))尿核苷单磷酸尿核苷单磷酸 胸腺嘧啶核苷酸胸腺嘧啶核苷酸 TKTK3.3.次要途径:胸腺嘧啶核苷(次要途径:胸腺嘧啶核苷(T T)) HATHAT培养基:培养基:H((Hypoxanthine)):次黄嘌呤次黄嘌呤A((Aminopterin):):氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断氨基喋呤;叶酸拮抗物,阻断DNA合成主要合成主要途径途径 T(Thymidine)::胸胸腺嘧啶核苷;腺嘧啶核苷;“核苷酸前体核苷酸前体”,供细胞通过替,供细胞通过替代途径合成代途径合成DNADNAHAT选择培养基的原理选择培养基的原理 HATHAT选择作用:选择作用:淋巴细胞:淋巴细胞:不能生长,不能生长,5 5~7 7天死亡;天死亡;DNADNA合成的主要途合成的主要途径被径被A A阻断阻断骨髓瘤细胞:骨髓瘤细胞:不能生长,不能生长,5 5~7 7天死亡;天死亡;HGPRTHGPRT缺乏,缺乏,DNADNA合成的替代途径受阻合成的替代途径受阻 克隆化:克隆化:指将抗体阳性孔进行克隆化。

      目的是将抗体分泌指将抗体阳性孔进行克隆化目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开分泌细胞分开克隆化的原则:克隆化的原则:尽早进行,反复尽早进行,反复4-5次次阳性杂交瘤细胞的克隆化阳性杂交瘤细胞的克隆化 有限稀释法有限稀释法(limiting dilution) 软琼脂平板法软琼脂平板法(soft agar method)单细胞显微操作法单细胞显微操作法(micromanipulation)荧光激活细胞分类法法(荧光激活细胞分类法法(fluorescence activated cell sorter,, FACS ))克隆化方案:克隆化方案: 特点:特点:不需任何特殊设备不需任何特殊设备克隆出现效率高克隆出现效率高实验室常用方法实验室常用方法方法:方法:细胞悬液通过系列稀释细胞悬液通过系列稀释每个培养孔含每个培养孔含0.50.5~~1 1个细胞个细胞有限稀释法有限稀释法 在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时,细胞培养过程中在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系时,细胞培养过程中随时可能发生细胞污染,分泌抗体能力丧失等随时可能发生细胞污染,分泌抗体能力丧失等“慢冻慢冻”::分步冷冻,分步冷冻,30℃→-70℃→30℃→-70℃→液氮液氮 “快融快融”::取出立即浸入取出立即浸入37℃37℃~~40℃40℃水浴中,使其迅速融化、水浴中,使其迅速融化、复苏复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存与复苏 防止污染防止污染避免染色体丢失避免染色体丢失防止非分泌细胞的过度生长防止非分泌细胞的过度生长防止细胞密度过高而死亡防止细胞密度过高而死亡细胞冷冻的意义细胞冷冻的意义 杂交瘤细胞检定杂交瘤细胞检定杂交瘤细胞检定杂交瘤细胞检定1.1.抗体分泌稳定性抗体分泌稳定性抗体连续传代法抗体连续传代法------保持稳定分泌特异性抗体保持稳定分泌特异性抗体2.2.细胞核学特征细胞核学特征检查细胞分裂中期染色体检查细胞分裂中期染色体------保证不丢失产生抗体基因的染色体保证不丢失产生抗体基因的染色体3.3.鼠源病毒检查鼠源病毒检查细胞试验,动物抗体产生试验,鸡胚感染试验等细胞试验,动物抗体产生试验,鸡胚感染试验等------排除单抗制品的排除单抗制品的病毒污染病毒污染4.4.支原体检查支原体检查荧光染色法,培养法,分子生物学法等荧光染色法,培养法,分子生物学法等——防止污染防止污染5.5.无菌试验无菌试验直接接种法,薄膜过滤法直接接种法,薄膜过滤法     二二 单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备 经过反复克隆化获得的经过反复克隆化获得的抗体阳性杂交瘤细胞株抗体阳性杂交瘤细胞株应立即扩应立即扩大培养(除及时冻存的细胞外)。

      因多次传代易引起大培养(除及时冻存的细胞外)因多次传代易引起染色体染色体逐渐丢失逐渐丢失而使细胞而使细胞产生抗体能力产生抗体能力逐渐减弱甚至消失,还应尽逐渐减弱甚至消失,还应尽早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体早使用获得的抗体阳性杂交瘤细胞株制备单克隆抗体 动物体内诱生方法:动物体内诱生方法: 操作简便,经济操作简便,经济主要用于生产科研或诊断用单抗主要用于生产科研或诊断用单抗腹水浓度可达腹水浓度可达2-5mg/ml2-5mg/ml实体瘤法、腹水制备法实体瘤法、腹水制备法体外培养法:体外培养法:使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞工艺简单、易控制,可大规模生产工艺简单、易控制,可大规模生产浓度不高,浓度不高,200-500ug/ml200-500ug/ml悬浮培养法、固相培养法悬浮培养法、固相培养法单克隆抗体的产生单克隆抗体的产生 腹水制备法腹水制备法 预先腹腔注射降直烷或液状石蜡预先腹腔注射降直烷或液状石蜡1-21-2周后注射(周后注射(1 1~~5 5))××10106 6细胞细胞1 1~~3 3w w形成腹水形成腹水5-20mg/ml,1-10ml5-20mg/ml,1-10ml高滴度腹水高滴度腹水 抗体特异性鉴定:抗体特异性鉴定: 抗原类似物的交叉反应抗原类似物的交叉反应IgIg类型、亚类鉴定:类型、亚类鉴定: 双扩法或双扩法或ELISAELISA法法McAbMcAb中和活性鉴定:中和活性鉴定: 动物或细胞的保护实验动物或细胞的保护实验McAbMcAb识别抗原表位测定:识别抗原表位测定: 用竞用竞 争结合法,测相加指数法争结合法,测相加指数法McAbMcAb亲和力测定:亲和力测定: ELISA ELISA 单克隆抗体性质鉴定单克隆抗体性质鉴定 注意事项注意事项1.1.污染污染细菌,真菌,支原体细菌,真菌,支原体2.2.杂交瘤细胞不分泌或停止分泌抗体杂交瘤细胞不分泌或停止分泌抗体HATHAT中中A A失效;失效;免疫原的抗原性弱,免疫效果差;免疫原的抗原性弱,免疫效果差;支原体污染;支原体污染;抗体非分泌细胞竞争性生长;抗体非分泌细胞竞争性生长;染色体丢失染色体丢失 预防措施预防措施1.1.大量保持和补充液氮冻存的细胞原管;大量保持和补充液氮冻存的细胞原管;2.2.倒置显微镜经常检查细胞生长状况;倒置显微镜经常检查细胞生长状况;3.3.不让细胞不让细胞““过度生长过度生长””4.4.不让培养物不加检查任其连续培养几周或几月;不让培养物不加检查任其连续培养几周或几月; 抗体的纯化:抗体的纯化:硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀凝胶过滤法凝胶过滤法离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀 大量的盐加入到蛋白溶液中,高浓度的盐离子有很强的水化力,大量的盐加入到蛋白溶液中,高浓度的盐离子有很强的水化力,可夺取蛋白质的水化层,使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出可夺取蛋白质的水化层,使蛋白质胶粒失水发生凝聚而沉淀析出 血清血清 50% 50%饱和度硫酸胺饱和度硫酸胺 上清上清 (清蛋白)(清蛋白) 沉淀(球蛋白)沉淀(球蛋白) 33% 33%饱和度硫酸胺饱和度硫酸胺 上清上清 沉淀沉淀 拟球蛋白拟球蛋白 r r球蛋白球蛋白 凝胶过滤法凝胶过滤法干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒,将蛋白质溶液加在凝胶干燥的凝胶颗粒吸水后形成了多孔胶粒,将蛋白质溶液加在凝胶柱上进行洗脱时,大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内,留柱上进行洗脱时,大分子蛋白不能穿过凝胶网孔进入胶粒内,留在胶粒间隙的溶液中,随洗脱液最先流出,小分子蛋白可穿过凝在胶粒间隙的溶液中,随洗脱液最先流出,小分子蛋白可穿过凝胶网孔进入胶粒内,受到凝胶的阻留,向下移动较慢洗脱出来较胶网孔进入胶粒内,受到凝胶的阻留,向下移动较慢洗脱出来较慢,据此将不同大小的蛋白质分离出来。

      慢,据此将不同大小的蛋白质分离出来交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶( (Sephadex)Sephadex)琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶( (Sepharose)Sepharose) 离子交换层析法离子交换层析法DEAEDEAE纤维素:结合溶液中带负电荷的蛋白质,又称阴离子交换剂纤维素:结合溶液中带负电荷的蛋白质,又称阴离子交换剂CMCM纤维素:结合溶液中带正电荷的蛋白质,又称阳离子交换剂纤维素:结合溶液中带正电荷的蛋白质,又称阳离子交换剂 亲和层析法亲和层析法将抗原(或抗体)连接到固相载体上,特异性吸附液相中的抗体将抗原(或抗体)连接到固相载体上,特异性吸附液相中的抗体(或抗原),形成抗原抗体复合物,然后改变条件,使抗原抗体(或抗原),形成抗原抗体复合物,然后改变条件,使抗原抗体复合物解离洗脱出纯化的抗体(或抗原)复合物解离洗脱出纯化的抗体(或抗原)A A蛋白蛋白- -Sepharose CL 4BSepharose CL 4B 三、单克隆抗体的应用三、单克隆抗体的应用检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂((1)病原微生物抗原抗体的检测)病原微生物抗原抗体的检测((2)肿瘤抗原的检测)肿瘤抗原的检测((3)免疫细胞及其亚群的检测)免疫细胞及其亚群的检测((4)激素测定)激素测定((5)细胞因子的测定)细胞因子的测定蛋白质的提纯蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术 。

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