微生物学：第七章 微生物遗传第三、四节.ppt

第三节第三节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一、基因突变●野生型菌株：从自然界分离获得的菌株，野生型菌株：从自然界分离获得的菌株，    称之为称之为~●基本培养基：满足野生型菌株生长基本培养基：满足野生型菌株生长最低营最低营   养要求养要求的合成培养基的合成培养基（一）突变类型（一）突变类型●营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失营养缺陷型：野生型菌株由于突变而丧失        了了 某种营养合成能力，而无法在基本培某种营养合成能力，而无法在基本培       养基上生长的变异类型养基上生长的变异类型    表示：表示：基基  因因：：his+，，his - ；； 表表 型型：：His + ，，His -●抗性突变型：野生型菌株由于突变而产抗性突变型：野生型菌株由于突变而产     了对某些化学药物或致死物理因子抗性了对某些化学药物或致死物理因子抗性     变异类型变异类型表示：表示：基基  因因：： strr、、strs；； tetr、、tets；； 表表 型型：：Str r ，， Str s●条件致死突变型：某些菌株或病毒经基因条件致死突变型：某些菌株或病毒经基因 突变后，在某种条件可生长并实现表型，而突变后，在某种条件可生长并实现表型，而在另一条件却无法生长繁殖的突变类型。

在另一条件却无法生长繁殖的突变类型        (如温度敏感突变株：如温度敏感突变株：Ts））●形态突变株形态突变株●抗原突变株抗原突变株●产量突变株产量突变株●突变株类型划分：突变株类型划分：     ----选择性突变株：选择性突变株：营养缺陷型、抗性营养缺陷型、抗性                             突变型、条件致死突变型突变型、条件致死突变型    ----非选择突变株：非选择突变株：形态、抗原、产量形态、抗原、产量                                  突变型突变型（二）突变率及其捡出（二）突变率及其捡出●突变率：某一细胞在每一世代中发生突突变率：某一细胞在每一世代中发生突    变的几率常用单位群体中每一世代产变的几率常用单位群体中每一世代产    生的突变株的数目来表示生的突变株的数目来表示●突变株的捡出及突变率的计算突变株的捡出及突变率的计算   捡出方法：捡出方法：1）选择性突变株）选择性突变株----营养缺陷型营养缺陷型  ----抗药性突变抗药性突变 2）回复突变）回复突变(三）基因突变的特点三）基因突变的特点1）非对应性；）非对应性；2）自发性；）自发性；3）稀有性；）稀有性； 4）独立性；）独立性；5）遗传和回复性；）遗传和回复性；6）可诱变性；）可诱变性；如何证明基因突变的非对应性和自发性？如何证明基因突变的非对应性和自发性？三个经典实验三个经典实验变量实验、涂布实验、影印实验变量实验、涂布实验、影印实验1) 变量实验变量实验2）涂布实验）涂布实验3）平板影印培养试验）平板影印培养试验（（四）基因突变及其机制四）基因突变及其机制1、诱发突变、诱发突变  (点突变点突变, 畸变畸变) )1)点突变点突变(1)碱基置换碱基置换   ---转换转换   ---颠换颠换●可能的可能的突变型：突变型：错错义义突变突变无义突变无义突变同义突变同义突变 ●相关的诱变剂相关的诱变剂－－直接引起置换：－－直接引起置换：    亚硝酸、亚硝基胍、羟胺、烷化剂亚硝酸、亚硝基胍、羟胺、烷化剂 －－间接引起置换：－－间接引起置换：    碱基类似物碱基类似物（（5 5－－BU, 5-AU)BU, 5-AU)(2(2）移码突变）移码突变 DNADNA序列中插入或缺失少数核苷酸，序列中插入或缺失少数核苷酸，从而使该处后面遗传密码的阅读框架发生改从而使该处后面遗传密码的阅读框架发生改变的突变。

变的突变2 2）染色体畸变）染色体畸变 DNADNA分子的大段损伤，包括缺失、重复、分子的大段损伤，包括缺失、重复、 插入、易位插入、易位（转座）（转座）和倒拉等和倒拉等●转座：转座：DNADNA分子通过分子通过非同源重组非同源重组方式，方式，      从染色体的某一部位转移到另一部位的从染色体的某一部位转移到另一部位的      现象 ●转座因子转座因子：凡具有转座作用的：凡具有转座作用的DNA序列序列     均称之均称之~   特点：特点：---转座作用转座作用---末端重复序列末端重复序列---转座酶基因转座酶基因●转座因子类型转座因子类型插入序列插入序列转座子转座子(或称或称复合转座子）复合转座子）转座噬菌体转座噬菌体    a））插入序列插入序列 (IS)                      b））   转座子转座子(Tn)●转座机理转座机理●转座子的遗传效应和生物学意义转座子的遗传效应和生物学意义（复制型转座）（复制型转座）遗传效应遗传效应1）插入突变）插入突变2））DNADNA重排重排意义：意义：进化，获得突进化，获得突变株，抗药性变株，抗药性 （五）紫外线对（五）紫外线对DNADNA的损伤及其修复的损伤及其修复1 1．损伤的机理：．损伤的机理：  形成胸腺嘧啶二聚体形成胸腺嘧啶二聚体2、、修复作用修复作用  1）光复活作用）光复活作用光解酶光解酶-二聚体复合二聚体复合物为光激活物为光激活 2.2.暗修复作用暗修复作用：：   二、二、    突变与育种突变与育种（一）自发突变与育种（一）自发突变与育种(定向培育）定向培育）（二）诱变育种（二）诱变育种1 1、基本原则（应考虑的问题）、基本原则（应考虑的问题）1 1）） 诱变剂的选择诱变剂的选择 ( (有效性有效性, ,安全性，简便性安全性，简便性) )●诱变剂诱变效果测定诱变剂诱变效果测定（回复突变率的测定）（回复突变率的测定）------艾姆氏试艾姆氏试 验验( (检测三致物质）检测三致物质）2 2）出发菌株）出发菌株3 3）诱变菌株的状态）诱变菌株的状态 --------处理单胞（孢）悬液处理单胞（孢）悬液 --------选择单倍体或单核细胞选择单倍体或单核细胞4 4）剂量：）剂量：低剂量；低剂量； ( (表示方法表示方法) )5 5）提高检出效率）提高检出效率 --------利用形态特征利用形态特征 --------鉴别培养基鉴别培养基●利用鉴别培养基检出突变株利用鉴别培养基检出突变株    ----蛋白酶高活性菌株的检出蛋白酶高活性菌株的检出     （酪蛋白为（酪蛋白为N源，加源，加HgCl2观察透明圈）观察透明圈）    ----淀粉酶高活性菌株的检出淀粉酶高活性菌株的检出     （淀粉为（淀粉为C源，加源，加I2液观察透明圈）液观察透明圈）   ----有机酸高产菌株的检出有机酸高产菌株的检出      （培养基加（培养基加CaCO3观察透明圈）观察透明圈）6 6）设计高效的筛选方案）设计高效的筛选方案 --------初筛（数量、定性）初筛（数量、定性） --------复筛（质量、定量）复筛（质量、定量）7 7）创新性的筛选方法）创新性的筛选方法 2 2、营缺型的筛选、营缺型的筛选（（1 1）三种培养基）三种培养基●基本培养基基本培养基[-][-] : :满足满足野生型野生型菌株生长菌株生长       最低营养要求的组合培养基。

最低营养要求的组合培养基●完全培养基完全培养基[+][+] ：：满足所有满足所有营缺型营缺型菌株菌株   生长营养要求的天然或半组合培养基生长营养要求的天然或半组合培养基●补充培养基补充培养基[A][A]，，[B][B] ：：满足相应营缺型菌满足相应营缺型菌       株生长营养要求的组合或半组合培养基株生长营养要求的组合或半组合培养基（（2 2）三类遗传型个体）三类遗传型个体●野生型：野生型：从自然界分离获得的菌株不论从自然界分离获得的菌株不论    营养状况如何，均称为营养状况如何，均称为~A+B + ））●营缺型营缺型：野生型菌株经诱变由于代谢障：野生型菌株经诱变由于代谢障 碍，而必须添加某种物质才能生长的突变碍，而必须添加某种物质才能生长的突变 株             （（A+B - ）） （（A-B + ））● 原养型原养型：营缺型回复突变后的菌株营缺型回复突变后的菌株 （（A+B + ））                基本基基本基 完全基完全基 补充基补充基野生型野生型 + + ++ + +营缺型营缺型 — + +— + +原养型原养型 + + ++ + +（（3 3）筛选步骤）筛选步骤        1）诱变）诱变    2）淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法）淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法    3）检出：）检出：   夹层培养法；限量补充法夹层培养法；限量补充法                         逐个检出法；影印平板法逐个检出法；影印平板法                        （（4 4）鉴定缺陷型）鉴定缺陷型( (生长谱法生长谱法) )1 1）制备基本培养基；）制备基本培养基；2 2）加充分洗）加充分洗 涤菌悬液；涤菌悬液；3 3）加待测营养物；）加待测营养物；4 4）观察生长。

观察生长●夹层培养法夹层培养法● 定位（点）诱变定位（点）诱变第四节第四节 基因重组基因重组 ●基因重组（遗传重组）：基因重组（遗传重组）：          两个独立基因组内的遗传物质，通过两个独立基因组内的遗传物质，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定的基一定的途径转移到一起，形成新的稳定的基因组过程因组过程●●遗传工程遗传工程    ----基因重组技术基因重组技术         经典、同源、生物自然属性、经典、同源、生物自然属性、         体内体内   ----DNA重组技术：重组技术：         分子水平、同分子水平、同-- 异源、体外异源、体外一、原核生物的基因重组一、原核生物的基因重组 （一）转化（一）转化      受体菌直接吸收供体菌受体菌直接吸收供体菌游离游离的的DNADNA 片段而获得部分遗传性状的现象片段而获得部分遗传性状的现象1 1、转化的基本条件、转化的基本条件（（1 1）感受态：）感受态： 受体菌最容易接受外源受体菌最容易接受外源DNA DNA 片段并能实现片段并能实现转化的一种生理状态转化的一种生理状态。

影响因素：影响因素： ------遗传因素（遗传因素（感受态因子感受态因子; ;种属的特异种属的特异性；）性；） ------外部因素（外部因素（CAMPCAMP、、聚乙二醇、二价阳聚乙二醇、二价阳 离子离子------低温低渗低温低渗CaClCaCl处理处理、培养条件）、培养条件）   ●●转化频率：转化频率：0.10.1～～1%1%（很低），最高（很低），最高10%10%，质粒，质粒 为良好的转化因子为良好的转化因子 ●●浓度：浓度： 1010-5-5 ugug/ml/ml●●结构：结构：一般转化因子都是线状双链一般转化因子都是线状双链DNADNA，，少数为少数为 线状单链线状单链DNADNA●●大小：大小：每一转化每一转化DNADNA片段分子量约片段分子量约 1×101×107 7，， 约占约占 染色体组染色体组0.3%0.3%，平均，平均 1515个基因。

个基因2 2）转化因子）转化因子●转化因子转化因子非交换非交换2 2、转化过程、转化过程 1 1）酶解和吸收单链）酶解和吸收单链2 2）同源区配对、）同源区配对、 整合整合3 3）复制）复制4 4）形成转化子）形成转化子5.5.转染转染(Tranfection)(Tranfection)提纯提纯的病毒的病毒DNADNA或或RNARNA进入宿主细胞并增进入宿主细胞并增殖出正常的殖出正常的病毒后代病毒后代现象原核生物遗传学慨念原核生物遗传学慨念--------不同于正常的噬菌体感染、也不同不同于正常的噬菌体感染、也不同 于转化于转化（二）转导（二）转导完全缺陷或部分缺陷噬菌体完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介为媒介, ,使受体细胞获得供体细胞部分遗传性使受体细胞获得供体细胞部分遗传性状的现象状的现象1 1、普遍转导、普遍转导 　　完全缺陷噬菌体对供体完全缺陷噬菌体对供体任何任何DNADNA小片小片段进行段进行““误包误包””, ,而将其遗传性状传递给而将其遗传性状传递给受体菌的现象，包括受体菌的现象，包括完全完全普遍转导和普遍转导和流产流产普遍转导两种类型。

普遍转导两种类型   ●●完全转导完全转导 ( (形成转导子形成转导子) )感染复数：感染的噬菌体数感染复数：感染的噬菌体数/被感染细胞数被感染细胞数●●●●流产转导：流产转导：流产转导：流产转导：( ( ( (不形成转导子不形成转导子不形成转导子不形成转导子, , , , 产生小菌落产生小菌落产生小菌落产生小菌落) ) ) )●经转导进入受体菌的供体菌经转导进入受体菌的供体菌DNA片段片段，，在受体菌内不交换、整合、在受体菌内不交换、整合、复制，也不迅速消失，仅进行转录、翻译、性状表达转导现象复制，也不迅速消失，仅进行转录、翻译、性状表达转导现象  ２、局限转导２、局限转导 部分缺陷的部分缺陷的温和噬菌体温和噬菌体把供体菌把供体菌少数特定少数特定的基因的基因携带到受体菌中并获得表达的转导现象携带到受体菌中并获得表达的转导现象 A A、、低频转导（ＬＦＴ）低频转导（ＬＦＴ）１）１）噬菌体感染噬菌体感染２）诱导裂解２）诱导裂解３）不正常切离（低频转３）不正常切离（低频转导裂解物）导裂解物）（（  dgal、、  dbio））４）４）形成形成局限转导子局限转导子B B、、高频转导（ＨＦＴ）高频转导（ＨＦＴ）1）概念）概念●低频转导低频转导(LFT)裂解物：裂解物：溶源溶源噬菌体感染后，噬菌体感染后， 带少数局限转导噬菌体带少数局限转导噬菌体的细胞的细胞裂解物。

裂解物●双重溶源菌：双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体同时感染有正常噬菌体   和缺陷噬菌体的受体菌和缺陷噬菌体的受体菌  (来源：来源：LFT裂解物以高的感染复数感染宿主裂解物以高的感染复数感染宿主)●双重溶源菌双重溶源菌2）高频转导）高频转导：在局限转导中，用双重溶源：在局限转导中，用双重溶源菌诱导后产生的高频转导裂解物转导受体菌菌诱导后产生的高频转导裂解物转导受体菌可获得的高达可获得的高达 50% 50% 的转导子，称之的转导子，称之~3）过程：）过程：1）双重溶源菌）双重溶源菌2）诱导，获得高频转导裂解物）诱导，获得高频转导裂解物3）高频转导裂解物）高频转导裂解物低低m.o.i感染受体菌感染受体菌（（3 3）溶源转变）溶源转变      温和噬菌体温和噬菌体 感染宿主后，宿主通过感染宿主后，宿主通过溶源化而获得免疫性以外新性状的现溶源化而获得免疫性以外新性状的现象●●白喉毒素：白喉毒素：白喉杆菌的白喉杆菌的ß-ß-噬菌体带有噬菌体带有““TOX”TOX”基因基因（三）接合（三）接合 ● 接合：通过细胞间的直接接触接合：通过细胞间的直接接触, ,由质粒由质粒 介导的遗传物质转移的现象介导的遗传物质转移的现象. .  ● 接合子接合子：：通过接合通过接合 而获得新的遗传而获得新的遗传 性状的受体细胞。

性状的受体细胞 ● 存在方式存在方式:四种接合型菌株四种接合型菌株1 1、、F F - - 2 2、、 F F+ + 菌株菌株Orit：：起始子起始子3 3、、HfrHfr菌株：菌株：高频重组菌株高频重组菌株，， F F+ +整合在染色体上整合在染色体上 成为附加体的状态，若与成为附加体的状态，若与F F - -接合，有很高接合，有很高的重组的重组 频率1 1）细胞接触）细胞接触2 2））HfrHfr断裂、断裂、 转移、复制转移、复制3 3）接合中断）接合中断4 4）形成接合子）形成接合子●利用利用接合中断法接合中断法绘制染色体图谱绘制染色体图谱4 4、、 F F ′′菌株菌株（质粒带有部（质粒带有部分染色体片断分染色体片断的菌株）的菌株）初生初生F F ′′菌株菌株次生次生F F ′′菌株菌株（四）原生质体融合（四）原生质体融合      通过人为方法通过人为方法, ,使遗传性状不同的两使遗传性状不同的两个细胞的原生质体融合个细胞的原生质体融合, ,继而遗传重组继而遗传重组, ,借以获得兼有双亲性状借以获得兼有双亲性状, ,遗传性稳定的遗传性稳定的融合子的过程。

融合子的过程●主要步骤：主要步骤： 1 1）选择亲本）选择亲本2 2）制备原生质体）制备原生质体3 3））原生质体再生原生质体再生4 4）促融）促融5 5）融合子检出）融合子检出6 6）筛选）筛选。