第十三章基因功能的验证.ppt

第十三章第十三章  基因功能的验证基因功能的验证 一是通过一是通过增强其表达增强其表达，取得表达产物进行研究，，取得表达产物进行研究， 增强其表达增强其表达因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛因为不能反映基因产物的真实表达情况，而逐渐被抛弃弃 二是二是减弱减弱或者或者终止其表达终止其表达，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因，观察整体功能的变化，进而推测相应的基因功能功能1 RNA干扰技术干扰技术           它是指它是指外源性外源性与与内源性内源性双链双链RNA触发编码区同源触发编码区同源mRNA 特异特异性的降解，而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水性的降解，而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默平，又称为转录后基因沉默(post-transcriptional  gene  silencing)当当dsRNA导入细胞后，被一种导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段核苷酸长的小片段，，这些片段可与该核酸酶的这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA。

   RNAi 技术的应用技术的应用 o在在功功能能基基因因组组研研究究中中，，需需要要对对特特定定基基因因进进行行功功能能丧丧失失或或降降低低突突变变，，以以确定其功能确定其功能o由由于于RNAi具具有有高高度度的的序序列列专专一一性性，，可可以以特特异异地地使使特特定定基基因因沉沉默默，，获获得得功功能能丧丧失失或或降降低低突突变变，，因因此此RNAi可可以以作作为为一一种种强强有有力力的的研研究究工工具具，，用于功能基因组的研究用于功能基因组的研究    在功能基因组中的应用在功能基因组中的应用 oo     基因敲除（基因敲除（基因敲除（基因敲除（knock out of geneknock out of gene）：利用基因打靶技术，用）：利用基因打靶技术，用）：利用基因打靶技术，用）：利用基因打靶技术，用无功能的外无功能的外无功能的外无功能的外源基因源基因源基因源基因转入细胞与基因组中同源序列进行转入细胞与基因组中同源序列进行转入细胞与基因组中同源序列进行转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组同源重组同源重组同源重组，把，把，把，把具有功能的同具有功能的同具有功能的同具有功能的同源序列置换源序列置换源序列置换源序列置换出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除。

出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除出来，造成功能基因的缺失或失活，这一技术叫基因敲除基因敲除技术基因敲除技术o构建重组载体构建重组载体o重组重组DNA转入受体转入受体 细胞核内细胞核内o筛选目的细胞筛选目的细胞o 转基因动物模型的建立转基因动物模型的建立 DNA-Binding  DomainBait ProteinPrey ProteinTranscription Activating RegionReporter GeneDNA-Binding Site酵母双杂交技术反式作用因子中的两个功能结构域反式作用因子中的两个功能结构域         DNA结合域结合域         转录激活结构域转录激活结构域o鉴定新的蛋白与蛋白相互作用o鉴定蛋白级联底物 o鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响o在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统)酵母双杂交系统应用酵母双杂交系统应用利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型o是一种在体外研究两种或多种蛋白质之间物理相互作用的方法拉下实验o基因组是指一个细胞单倍型所含的全部遗传信息，即基因组是指一个细胞单倍型所含的全部遗传信息，即DNA或或RNA编码的遗传信息编码的遗传信息o蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白质组则是指一个细胞一生中表达的蛋白质总和蛋白组学研究o蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新的领域，主要研究蛋白质的蛋白质组学是研究蛋白质组的一个新的领域，主要研究蛋白质的特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和特性，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质蛋白质相互作用相互作用，在，在蛋白质水平上蛋白质水平上了解细胞的各项功能、各种生理生化了解细胞的各项功能、各种生理生化过程及疾病的病理过程等过程及疾病的病理过程等人体内肝癌细胞的转移与细胞中第８号染色体短臂的缺失密切相关人体内肝癌细胞的转移与细胞中第８号染色体短臂的缺失密切相关人体内肝癌细胞的转移与细胞中第８号染色体短臂的缺失密切相关人体内肝癌细胞的转移与细胞中第８号染色体短臂的缺失密切相关o蛋白质双向电泳(two-dimensional eleclrophoresis，2-DE)是一种方便、灵敏的蛋白质分离方法o第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等电第一相电泳根据蛋白质的不同等电点分离各种蛋白质，即等电聚焦法聚焦法(isoelectrie focusing IEF)o第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同的第二向电泳根据蛋白质的不同分子量进一步分离等电点相同的蛋白质，即蛋白质，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)o双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一双向凝胶电泳技术是目前蛋白质组研究的主要技术之一, 双向电泳双向电泳根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白根据等电点和分子量可一次性分离数千种蛋白质，经染色后蛋白质再质再PAGE上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱。

上可形成密度不同、分布不均的复杂点图谱o如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息是双向电泳分析软件所要解决的问题信息是双向电泳分析软件所要解决的问题差异点：差异点：蛋白质的分离与鉴定o蛋白质经双向电泳分离及图像分析后，将蛋白质斑点胶块切下，用蛋白酶通常用胰蛋白酶)对蛋白质样品进行胶内酶解，获得肽片段。