柱效测定以及影响因素.doc

GEHealthcareLifeSciences柱效测定以及影响因素柱效（columnefficiency）是色谱柱在色谱分离过程中主要由热力学因素（操作参数）所决定的分离效能通常用理论塔板数.有效塔板数、理论塔板高度、有效塔板高度等表示柱效是衡量色谱柱性能的一项主要指标•柱效越高.分离能力越强°折合的塔板高度h=HETP/d/P对称性As"达到最大峰高的时间（或洗脱体积）所对应的停留时间｛停留体积）相对峰宽通常用理论塔板（N）,理论塔板数（HETP）或折合为塔板高度（h）来进行描述：Uf2N=七=5.54aHETP=-NHETP..-——5.54（—）dpdpdp\Vh/对称因子As描述了与理想高斯峰形状的偏bAs=-a术语塔板数平均停留时间*方差*2Ml停留时间"停留体积"Vr半峰高峰宽Wh颗粒半径d/P理论塔板数HETPimaginationatworkTogether,wecanmaketheworldhealthierthroughimaginativescienceGEHealthcareLifeSciences对于生物过程色谱中使用的有孔介质.其最佳柱效时实验测定的塔板高度h小于等于3。

就峰的对称性而言，理想对称性为接近As=lo当工作中折合塔板高度hC3时，一般能接受的范圉通常在0.8・1.8之间需要谨记的是以柱宽而言，柱效越低通常意味着库对称性越好或者以N/m（每米的理论塔板）来表示，对于不同颗粒大小的填料，达到以下的数值，即可认为柱效比较好:颗粒大小（pm）介质实例N/mAs15SOURCE™15〜200000・8~l・530SOURCE30~110000.8〜1534SepharoseHighPerformanee.>100000・8~l・8Superdex™.Superose>100000・7~l・350Sephacry卩”-90000・8~l・575-100SepharoseFastFlow,SepharoseXL,〜30000・8~l・5Capto™.MabSelect™0・8~l・6柱效测定主要影响因索：1•柱效测定使用的检测物检测物的选择需要保证物质大小（分子量）能完全渗透进入层析介质的孔隙结构内必须避免检测物与层析介质发生表面相互作用，以保证检测物是化学惰性和稳定的此外，洗脱成分和样品的粘度和密度差异应降低至最小，以避免由不稳定流动模式（粘度指纹效应）造成的系统误差。

通常使用的，鉴符合这些雯求的样品/洗脱系统为水丙10和盐系统’这些系统可分别通过测定吸收值和电导进行监测根据层析介质的化学属性，推荐以下样品和洗脱液：介质洗脱液样品除疏水合成聚合物，RPC和HIC介质以外的所有介质水1-2%丙酮水溶液RPC和HIC20%乙醇1-2%丙喇.至少20%的乙醇所有介质0.4MNaCI（溶于水）0.8MNaCI（溶于水）当使用NaCI作为检测物时.洗脱液中至少要用0.4MNaCI（35・40mS/cm）对检测物和层析介质之间的电荷相互作用进行有效地抑制，否则可能会导致不恰当的检测结果发生如果发主相互作用时，峰对称性受到破坏2液财速imaginationatwo「k峰的展宽程度以及导致的色谱的柱效取决于检测过程中所使用的液体流速理论上,之间的关系可通过范德姆特方程进行描述：BHETP=A+—+CXp65X321工一耳-Redi>:edd石於rekgnt15C1AC13C12C11C枉效在很大程度上峰展竟和液体流速其中A指的是湍流扩散；B指的是分子质阻力；u指的是液体流速（cm/h）102033co5060Velociy(cmfh)n——i——i——ICC7030^0100扩散；C指的是传右图实验分析所反应的液体流速对柱效柱效的影响。

当液体流速在20cm/h左右时折合塔板高度最小且柱性能最大当速度降低时，由于范德姆特方程中B对应的分子扩散使得柱效柱效有所降低在高检测速度时，由于在层析柱中保留时间缩短，根据范德姆特方程中C代表的粒内扩散受到限制，导致峰宽增加值得一提的是图中的峰的对称性随液体速度的提高而减小，这主要还是由于建立的检测方法减小峰的展宽从而影响到对称性允许标准h<3保证了合适液流速度，从而可以得到最佳的理论柱效柱效颗粒大小（扩散的特征长度）是决定最佳流速的主要参数（下表）颗粒大小（pm）介质实例速度(cm/h)15SOURCE™156030SOURCE306035SepharoseHighPerformance,Superdex™3050Sephacryl™2075-100SepharoseFastFlow,Capto™.MabSelect™20200SepharoseBigBeads103样品体积柱效柱效测试通常便用的样品体积为1%的柱体积（Vcl.当某些硬件条件无法满足时，可以在经验范围内进行微小优化以加强对示踪物质的检测能力然而，值得一提的是，对于柱效好的柱子来说实验中样品体积可能导致色谱悸明显加宽，降低塔板数，这一点对于小颗粒直径的层析介质而言尤为常见。

由于峰宽增大，峰对称性可能有所改善这一点与增加检测流速的效果类似4•检测系统的滞留体积（系统死体积）外体积（Vext）应尽量保持足够的低这一体积指的是上游体积（从上样点到柱体之间）和下游体积（从柱底到检测器）之和与扩大样品体积的效果类似，不恰当的检测系统设置也会影响所测试的柱效柱效因此用于imaginationatworkTogether,wecanmaketheworldhealthierthroughimaginativescieneeGEHealthcareLifeSciences检测的管路应尽可能的短，并且内径应量小且不会造成过大压降.作为一个普遍的经验法则，一个主物过程层析便用的典型层析柱的柱效检测应保证外体积小于柱体积的5%,如想获得最佳柱效则II便外体积小于3%在测定柱效前最好测定系统外体积此外，还需要对柱效检测中的保留体积进行记录，以便和填充床以及柱本身的标称保留体积进行比较若保留体积远大于预期，则提示检测物和层析介质之间可能存在相互作用，以及柱外检测系统存在滞留体积当检测设置一经确立，层析柱安装完毕，需要进行连续三次检测以确认该方法的可重复性imaginationatworkTogether,wecanmaketheworldhealthierthroughimaginativescienee。