双荧光素酶检测原理和方法总结.docx

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操作流程：1、细胞培养和转染1） 将指数期细胞传到孔板中，转染时细胞密度约为 70%；2） 根据转染的孔的大小，按照一定比例混匀质粒；3） 取一个新的1.5ml离心管，加入lipofectamine 2000和Opti-MEM，轻轻混匀后室 温静置 5min；4） 将4中的混合液加入3的EP管中，混匀；5） 室温静置20min，将lipofectamine 2000-质粒混合液滴至U孔板中；6） 4h 后换回含血清的完全培养基2、Luciferase 活性检测1） 取出细胞，室温下吸去培养基，1xPBS洗一遍，每孔加入100ul 1 x passive lysis buffer2） 把孔板放在摇床上摇15min，转移到EP管中用于后续实验或储存3） 准备好底物，将LAR II从-80°C中取出解冻；Stop and Glo :把50xStop and Glo substrate 用 Stop and Glo buffer 酉己成 1x；避光放置4） 把细胞裂解液转移到标记好EP管中，瞬时离心；5） 标记好测量管，每管加入适量细胞裂解液；6） 按说明书设置程序；刀 每测量管加入100ul LAR II溶液，快速混匀，测量；8）每测量管加入100ul Stop and Glo溶液，快速混匀，测量；9) 整理数据。

试剂：1) Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent2) Dual-Luciferase® Reporter Assay System3) PBS 缓冲液4)培养基(GIBCO)。